紫草素对斑马鱼胚胎毒性和血管抑制作用

何育霖， 杨雨婷， 何贝轩， 李玉芝， 曹治兴， 彭 成

（成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）



紫草素对斑马鱼胚胎毒性和血管抑制作用

何育霖， 杨雨婷， 何贝轩， 李玉芝， 曹治兴*， 彭 成*

（成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

摘要:目的 评价紫草素（shikonin）对斑马鱼的胚胎发育毒性及其血管抑制作用。方法 将受精后0、10、24、48 h （hours Post ferti1ization，hPf）发育正常的斑马鱼胚胎分别置于含有不同剂量紫草素的胚胎培养液中12、24、36、48 h后，显微镜下观察紫草素对斑马鱼胚胎的畸形率、死亡率、心率和血管生成的影响。结果 给药24 h后，紫草素对不同发育阶段斑马鱼的LD50在0.73～1.56 mg/L之间。给药48 h后，该LD50值在0.25～0.39 mg/L之间。在给药大于0.5 mg/L时，紫草素能在12 h内引起斑马鱼的发育畸形，分别在1 h和24 h内均能引起斑马鱼心率衰减（P＜0.01），在12 h内可以显著抑制斑马鱼正常血管的生长。结论 紫草素对斑马鱼胚胎发育具有毒性，并对斑马鱼血管生成具有一定的抑制作用。

关键词:紫草素；斑马鱼；胚胎；毒性；血管生成

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.003

KEY W 0RDS: shikonin；zebrafish；embryos；toxicity；angiogenesis

紫草为紫草科（Boraginaceae）多年生草本植物，中医认为紫草味苦、性寒，有凉血、活血、解毒和透疹等功能，长期用于疮疡、淋浊、热症等［1］。紫草素（shikonin）是从中国传统中药材—紫草的根中含量最高的一种萘醌类化合物（图1），大量研究已证实其良好的抗肿瘤［2-3］、抗炎［4-5］、抗血管生成［6-7］等药理作用。但目前对紫草素毒性方面研究的相关报道较少。

斑马鱼属脊椎动物，是一种新型模式动物。斑马鱼个体小、发育快，其主要组织的形态结构、生理功能、基因结构和功能、基因调控途径以及疾病特征等都与人类相似［8］。斑马鱼遗传背景清晰，对有害物质非常敏感，对药物反应与人临床反应相似。已有大量实验研究证明斑马鱼非常适用于中药多种人类重大疾病治疗的药理学和毒理学研究［9-10］。斑马鱼的血管生成过程与哺乳动物相似，从主动脉分出的节间血管从受精后24 h（hours Post ferti1ization，hPf）发育生长，48 hPf发育基本完全。因此，本实验以斑马鱼胚胎为模型，旨在探究紫草素对斑马鱼生长发育的毒性并探讨紫草素对斑马鱼正常血管的影响，为紫草素的深入研究提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 药物与仪器 紫草素购于成都曼思特生物科技有限公司（批号MUST-74072310），经HPLC鉴定，纯度＞98.6％。先用二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma-A1drich公司）溶解为母液，再用斑马鱼胚胎培养液稀释至实验剂量；斑马鱼拍照时用固定液（4％甲基纤维素溶于培养液中）固定。斑马鱼繁育与养殖系统（北京爱生科技公司）；Axio Observer A1荧光倒置显微成像系统（德国Zeiss公司）；M165-FC体式荧光显微成像系统（德国Leica公司）；恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；AL104电子天平（瑞士Mett1er To1ed公司）。

1.2 斑马鱼饲养和繁育条件 无病原体［血管绿色荧光标记的转基因Tg（f1k1∶GFP），AB品系］斑马鱼，由成都中医药大学药学院斑马鱼实验平台培养繁殖。斑马鱼饲养于全封闭循环系统，养殖和繁殖均参照zebrafish book［11］标准，斑马鱼房内光照/黑暗比为14 h/10 h，室内温度26℃，水温28℃，PH 7.2～7.5，电导率500～550 μs/cm，其各项水质指标均合要求。繁育前，将雌雄以1∶1数量移入产卵盒，并用隔板将雌雄分开，次日清晨移去隔板雄鱼追逐雌鱼后30 min便可收集胚胎。胚胎用培养液清洗干净移入无菌培养皿后，置于恒温培养箱中。

1.3 紫草素对斑马鱼胚胎致死率和致畸率的测定选择发育正常的0、10、24、48 hPf胚胎期斑马鱼随机放入24孔板中，每孔10枚胚胎，每组50枚。将紫草素母液稀释至以下剂量组: 3、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.0、0.75、0.5、0.25 mg/L，同时设空白对照组和0.1％ DMSO组。吸取原培养液，按组分别加入1 500 μL含药工作液，于恒温培养箱中继续孵育，每12 h观察1次，继之用胚胎培养液润洗，然后将斑马鱼胚胎放至具有凹槽的载玻片上，4％甲基纤维素固定，体视显微镜下观察斑马鱼胚胎死亡率、畸形率，并进行拍照。

1.4 斑马鱼心率及心脏形态的测定 选择发育正常的24 hPf、48 hPf胚胎期斑马鱼随机放24孔板中，每孔10枚，即每组50枚胚胎。设空白对照组和紫草素试药组（3、1.5、1.0、0.75、0.5 mg/L），按组分别在孔内加入1 500 μL各工作液，于恒温箱中培育，24 hPf胚胎期在给药24 h后观察，48 hPf胚胎期给药组在给药1 h后进行观察，在显微镜下用计时器计数各组胚胎在60 s内的心跳次数。

1.5 斑马鱼体节间血管荧光观察 选择发育正常的24 hPf的胚胎期斑马鱼（FLk-eGFP），随机放入24孔板中，每孔10枚，每组50枚。设空白对照组和紫草素试药组（3、1.5、1.0、0.75、0.5 mg/L），按组分别在孔内加入1 500 μL各工作液，并放入恒温箱中培养。在药物作用12 h后，在体式荧光显微镜下观察荧光血管的生长情况，并利用成像系统拍摄照片。

1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 17.0统计软件和Origin 75软件进行分析，死亡率、心率的试验结果以平均值±标准差（±s）表示，组内比较采用t检验，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对斑马鱼死亡率的影响 紫草素对各个发育阶段的斑马鱼均具有致死性，对发育阶段越早的胚胎其毒性越大，各组胚胎的死亡率随给药剂量和时间的增加而增加。紫草素作用于0、10、24、48 hPf胚胎12、24、36、48 h的LD50如表1所示。由表1可知，紫草素作用于早期发育阶段的胚胎，随时间的增加毒性增加。

表1　紫草素对斑马鱼胚胎LD5 0（±s，n=5）Tab.1 Effects of shlkonln on LD50of zebraflsh embryo （±s，n=5）

表1　紫草素对斑马鱼胚胎LD5 0（±s，n=5）Tab.1 Effects of shlkonln on LD50of zebraflsh embryo （±s，n=5）

发育时间点/h给药后不同发育时间点LD50/（mg·L-1）0 hPf　 10 hPf　 24 hPf　 48 hPf 12　 1.25±0.03 1.51±0.12 1.56±0.13　 3.02±0.15 24　 0.85±0.04 0.73±0.11 0.94±0.14　 1.56±0.24 36　 0.21±0.01 0.52±0.08 0.63±0.50　 0.92±0.12 48　 0.25±0.04 0.28±0.03 0.32±0.06　 0.39±0.16

2.2 紫草素对斑马鱼畸形率的影响 紫草素可导致斑马鱼胚胎发育畸形。紫草素作用于10 hPf胚胎期斑马鱼12 h后，结果显示，0.5 mg/L紫草素组胚胎发育延迟，眼点浑浊，0.75 mg/L紫草素组胚胎节数与空白对照组相比减少，1.0 mg/L紫草素组胚胎发育非常迟缓，眼点、脊柱、尾部均未发育（图1A～D）。紫草素作用于24 hPf胚胎24 h后，结果显示，给药组身体弯曲，尾部畸形，节数变短，黑色素明显减少（图1E～G）。紫草素作用于10 hPf、24 hPf胚胎期斑马鱼后不同时间测定的畸形率结果见图2～3。紫草素各剂量组的畸形率与空白对照组相比，均具有显著性差异，且随着时间的增加其致畸性越强。

图1　1 0 h p f（A～D）和2 4 h p f（E～G）加药后紫草素对斑马鱼胚胎发育的影响Flg.1 Effect of shlkon ln concentratlons on the developmental zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 10 hp f（A～D）and 24 hpf（E～G）

图2　紫草素对斑马鱼胚胎畸形率的影响（1 0 h p f）Flg.2 Effect of shlkonln on rate of teratogeny to zebraflsh embryos development adm lnlstratlng for 10 hpf

图3　紫草素对斑马鱼胚胎畸形率的影响（2 4 h p f）Flg.3 Effect of shlkonln on rate of teratogeny to zebraflsh embryos development adm lnlstratlng for 24 hpf

2.3 紫草素对斑马鱼心率的影响 紫草素作用于24 hPf胚胎期斑马鱼24 h后，0.5 mg/L紫草素组斑马鱼心率与空白对照组相比降低（P＜0.05），0.75 mg/L和1 mg/L紫草素组斑马鱼心率与空白对照组相比均下降（P＜0.01），且具有剂量依赖性。紫草素作用于48 hPf胚胎期斑马鱼1 h后，0.5 mg/L紫草素组斑马鱼心率与空白对照组相比降低（P＜0.05），1.5 mg/L和3 mg/L紫草素组斑马鱼心率明显降低，具有心脏急性毒性，与空白对照组相比差异均有显著性（P＜0.01）。结果见表2～3。

表2　紫草素对2 4 h p f斑马鱼胚胎心率的影响（±s，n=5）Tab.2 Effect of sh lkonln on the heart rate of zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 24 hpf（±s，n=5）

表2　紫草素对2 4 h p f斑马鱼胚胎心率的影响（±s，n=5）Tab.2 Effect of sh lkonln on the heart rate of zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 24 hpf（±s，n=5）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

紫草素/（mg·L-1）　　心率/s-10 146.5±2.21 0.5　134.5±1.26*0.75　90.0±1.50**1 60.0±1.41**

表3　紫草素对4 8 h p f斑马鱼胚胎心率的影响（±s，n=5）Tab.3 Effect of shlkonln on the heart rate of zebraflshembryos adm ln lstratlng for 48 hp f（±s，n=5）

表3　紫草素对4 8 h p f斑马鱼胚胎心率的影响（±s，n=5）Tab.3 Effect of shlkonln on the heart rate of zebraflshembryos adm ln lstratlng for 48 hp f（±s，n=5）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

紫草素/（mg·L-1）　　心率/s-10 142.0±2.41 0.5　139.0±1.29*1.5　95.5±0.96**3 49.5±1.26**

2.4 紫草素对斑马鱼血管生成的影响 紫草素作用于24 hPf胚胎期斑马鱼12 h后，结果显示，与空白对照组相比，紫草素各剂量组体节间血管长度有显著性差异，且呈剂量依赖性抑制（图中红色箭头表明节间血管受到抑制），随着剂量的增加，毒性也随之增加。结果见图4。

图4　紫草素对2 4 h p f斑马鱼胚胎节间血管生成的影响Flg.4 Effect of shlkonln on the anglogenesls of zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 24 hp f

3 讨论

紫草素是紫草内最主要的有效成分，《中国药典》2010版将紫草素作为中药紫草的含量和质量测定指标［12］。传统医药学将紫草作为外用药物，用于治疗温病血热毒胜、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等多种外伤和皮肤病，历史上许多医家多认为紫草无毒或低毒，如《别录》中记载“无毒”［1］，可能是因为药物外用后，紫草素进入体内的量非常少，不会达到有毒浓度。

现代药理研究表明紫草素具有抗肿瘤、抗炎、抗血管生成等多种药理作用，临床应用广泛［13］。但在研究上述新作用的体内实验中发现其具有较高的长期毒性和急性毒性［14-15］。因此，本实验研究紫草素对各发育期斑马鱼的生长发育、心率和血管的影响。结果表明，紫草素＞0.5 μg/mL时即可导致各个发育阶段的斑马鱼畸形，并在作用时间大于24 h后，表现出显著增高的死亡率。

心率是体现心脏功能的一个重要指标，斑马鱼胚胎发育48 h后心率即趋于稳定。本实验发现，紫草素不但在长时间作用下能导致斑马鱼胚胎心率明显降低，而且在作用1 h的短时间内即可导致斑马鱼心率迅速减慢，表现出显著的急性心脏毒性。

血管新生是指在原有血管的基础上形成新的血管，涉及内皮细胞增殖、迁移、基底膜降解、血管官腔形成等一系列复杂的生物学过程［7］。研究表明，血管生成对肿瘤的生长和转移至关重要，切断肿瘤组织从血管中获得营养途径已经成为新的肿瘤治疗靶点［16］。已有研究发现紫草素具有抗血管生成的作用，是治疗肿瘤的前景药物［6-7］。本实验结果显示，与空白对照组相比，紫草素能够显著抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成，且呈剂量依赖性，伴随毒性的产生。

综上所述，紫草素对各个发育阶段的斑马鱼具有全身多个器官的毒性，可能正因如此，使其在新药研发研究中存在局限性。因此，以紫草素为先导，将结构进行改造以降低其毒性，提高其选择性是目前亟待解决的问题和研究热点。

参考文献:

［1］ 南京中医药大学.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，2006.

［2］ Wang Y W，Zhou Y N，Jia G，et al.Shikonin suPPresses tumor growth and synergizes with gemcitabine in a Pancreatic cancer xenograft mode1: Invo1vement of NF-κB signa1ing Pathway［J］.Biochem Pharmacol，2014，3（88）: 322-333.

［3］ Chen Y Q，Zheng L，Liu JQ，etal.Shikonin inhibits Prostate cancer ce11smetastasis by reducingmatrix meta11oProteinase-2/-9 exPression via AKT/mTOR and ROS/ERK1/2 Pathways［J］. Int ImmunoPharmacol，2014，2（21）: 447-455.

［4］ Liang D J，Sun Y，Shen Y B，et al.Shikonin exerts anti-inf1ammatory effects in a murine mode1 of 1iPoPo1ysaccharide-induced acute 1ung injury by inhibiting the nuc1ear factor-kaPPaB signa1ing Pathway［J］.Int ImmunoPharmacol，2013，16（4）: 475-480.

［5］ Xiong J，Ni JB，Hu GY，etal.Shikonin ame1iorates ceru1eininduced acute Pancreatitis in mice［J］.J EthnoPharmacol，2013，145（2）: 573-580.

［6］ 袁定芬，邓 辉，阎春林，等.紫草素对内皮细胞血管新生活性的影响［J］.中药临床药理学与治疗学，2006，11 （11）: 1253-1255.

［7］ Xu Y Y，Xu X G，Gao X H，etal.Shikonin suPPresses IL-17-induced VEGF exPression via b1ockage of JAK2/STAT3 Pathway ［J］.Int ImmunoPharmacol，2014，19（2）: 327-333.

［8］ 卜纪雯，马 军.斑马鱼重要基因对心脏发育关键环节的调控［J］.安徽农业科学，2008，36（14）: 5844-5846.

［9］ 张启春，杨雨微，卞慧敏.马钱子碱及生物转化氮氧化物对斑马鱼胚胎毒性的研究［J］.中成药，2011，33（10）: 1664-1668.

［10］ 张利君，史慧勤，苑晓燕，等.多柔比星斑马鱼胚胎心脏发育毒性表现［J］.中国药理学与毒理学杂志，2013，27 （2）: 429-433.

［11］ Westerfie1d M.The zebrafish book: a guide for the 1aboratory use of zebrafish（Danio rerio）［M］.4th ed.Eugene: University of Oregon Press，2000.

［12］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典: 2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010: 30.

［13］ 李 亮，陈钰沁，张 超，等.紫草素的研究进展［J］.云南中医学院学报，2011，34（5）.63-66.

［14］ 戴 冰，曹璐婷，肖子曾，等.新疆软紫草石油醚提取物对小鼠及其靶器官的毒性影响［J］.中药药理与临床，2015，31（1）: 47-150.

［15］ 桂 春，陈蒙华，林 松，等.乙酰紫草素对培养大鼠心肌细胞的毒性作用［J］.中药药理与临床，2010，26（6）: 33-36.

［16］ 丁志山，沃兴德.中药对血管生成的影响［J］.中国中西医结合杂志，2002，22（3）: 221-223.

Effects of shlkonln on zebraflsh's embryo and anglogenesls

HE Yu-1in， YANG Yu-ting， HE Bei-xuan， LIYu-zhi， CAO Zhi-xing*， PENG Cheng*
（DeveloPment and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

ABSTRACT:AIM To eva1uate shikonin on the deve1oPmenta1 toxicity and vascu1ar inhibition of zebrafish embryos.METH0DS Post ferti1ization embryos of zebrafish were exPosed to shikonin at a series concentrations for 0，10，24，or 48 hours.The inf1uence of shikonin on the embryos deve1oPment and angiogenesis of zebrafish was observed with microscoPe；their embryo deformity rate，morta1ity rate and heart ratewere a1so ana1yzed.RESULTS After treating for 24 h，the LD50of shikonin on the embryo at the deve1oPmenta1stages ranged from 0.73 -1.56 mg/L.After treating for48 h，the LD50of shikonin ranged from 0.25 -0.39 mg/L.When treated at concentrations greater than 0.5 mg/L，shikonin caused the embryo deformity in 12 h；decreased its heart beat in 1 and 24 h （P＜0.01）；inhibited the vesse1growth of zebrafish in 12 h.C0NCLUSI0N Shikonin has the toxic effects on the deve1oPment of zebrafish embryos and the growth inhibitory effects on zebrafish's angiogenesis.

*通信作者:曹治兴（1984—），男，博士，助理研究员，主要从事中药药理与毒理研究。Te1:（028）61800234，E-mai1: caozhixing007 @163.com 彭 成（1964—），男，博士，研究员，博士生导师，主要从事中药药理与毒理研究。Te1:（028）61800005，E-mai1: Pengchengchengdu@126.com

作者简介:何育霖（1995—），女，主要从事中药药理学研究。Te1: 18380445395，E-mai1: hy119951205@163.com

基金项目:国家自然科学基金（81300437）

收稿日期:2015-06-15

中图分类号:R966

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0241-05