戊型肝炎病毒在长爪沙鼠体内消长规律研究

尤　华，张　佳，李　箐，严红亚，宋春莲，尹革芬，舒相华，李文贵*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125;2.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;3.云南省普洱市思茅区动物卫生监督所,云南普洱 665000)



戊型肝炎病毒在长爪沙鼠体内消长规律研究

尤华1，张佳2，李箐3，严红亚2，宋春莲2，尹革芬2，舒相华2，李文贵2*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125;2.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;3.云南省普洱市思茅区动物卫生监督所,云南普洱 665000)

摘要：为掌握戊型肝炎病毒(HEV)感染长爪沙鼠后各组织器官中病毒的载量及消长规律，以1株云南猪源HEV感染ZCLA长爪沙鼠，采用实时荧光定量PCR相对定量法，对不同感染时间的血液、粪便及肝、肠等组织中的病毒进行测定。结果表明，从感染3 d后开始，长爪沙鼠血液、粪便、肝、肠和胆汁中均能检测到病毒，以肠和胆汁中含量最高，感染5周后各组织中还能检测出病毒。研究结果为建立长爪沙鼠感染HEV模型，揭示HEV复制与疾病进程的关系、致病机理，以及建立防控技术等奠定基础。

关键词：戊型肝炎病毒；感染模型；病毒消长；长爪沙鼠

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)引起的一种人兽共患病，主要经污染水源传播，也有证据表明可从其他动物、输血或垂直传播等途径传播。HEV是一种单股正链RNA病毒，具有变异性强、宿主范围广、易降解、不稳定和从载毒标本(如粪便、胆汁等)中分离高含量的纯病毒较难等特性，在很大程度上限制了致病机理、越种传播等的研究及疫苗研发。

国内外学者对应用恒河猴、黑猩猩、短尾猴等非人灵长类，猪、兔等动物以及传代细胞等作为感染模型的可能性进行了探索[1]。恒河猴、黑猩猩虽易感，但价格高、操作难，还存在医学伦理等问题。猪、兔相对成本低，操作简便，但猪仅感染基因3/4型，试验操作难度大，而兔仅感染与现有4个基因型有很大差异(核苷酸同源性70%～83%)的兔源HEV[2]。除此以外，人胚肺二倍体传代细胞系、猪肝脏干细胞系、人肝癌细胞系和肺癌细胞系等均可用于HEV培养[3]，但应用前景远不及动物感染模型。

目前已证实长爪沙鼠对HEV易感，感染后引起的肝脏、脑组织等损伤，组织病理学变化与人感染HEV后相似[4]。然而，在作为感染模型应用之前，还须完成长爪沙鼠对不同HEV基因型的易感性、体内病毒载量及分布、感染后的免疫应答等的研究。本研究以1株云南猪源HEV感染长爪沙鼠，采用实时荧光定量PCR相对定量法，对血液、粪便及肝、肠等组织中的病毒进行了测定，为完善HEV长爪沙鼠感染模型基础数据，进一步研究该病毒复制与疾病进程的关系、揭示HEV致病机制和预防控制技术研究等奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与种毒4月龄ZCLA 长爪沙鼠30只，购自浙江省医学科学院实验动物中心。种毒swYN-2为云南猪源基因4型HEV，由云南农业大学动物科学技术学院动物医学实验教学中心分离保存。

1.1.2主要试剂质粒小量提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；Eastep通用型总RNA提取试剂盒，Promega公司产品；反转录试剂PrimeScript RT、荧光染料SYBR○RPrime ExTaqTⅡ，宝生物工程(大连)有限公司产品；两步法反转录试剂盒、TransHIFI PCR MIX，全式金(北京)公司产品；HEV-IgG ELISA 试剂盒(双抗夹心法)，北京万泰药业有限公司产品；HEV特异引物、管家参照基因各1对，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

1.2方法

1.2.1攻毒及采样长爪沙鼠攻毒组15只，对照组15只(为防止意外死亡，各组备用1只)，用HEV IgG ELISA 试剂盒检测抗体，结果全为阴性。试验过程中全部单独隔离饲养。

取实验室保存的种毒swYN-2，给每只攻毒组沙鼠腹腔注射0.8 mL病毒悬液，对照组每只注射等量的生理盐水，于攻毒后感染后第5天(5 DPI)、11、16、21、28 DPI处死攻毒组、对照组各2只，分别采集粪便、血液、胆汁、心和肝等样本，置-80℃保存备用。

表1　试验所用引物

1.2.2总RNA 提取与cDNA 制备

1.2.2.1总RNA提取按Eastep 通用型总RNA提取试剂盒说明书提取样本组织的总RNA，紫外分光光度计检测浓度并调至500 ng /μL，置-80℃ 保存备用。

1.2.2.2质粒标准品的制备按RNA逆转录试剂盒说明书将提取的总RNA逆转录制备cDNA，置-20℃保存备用。普通PCR扩增目的基因，20 g/L琼脂糖凝胶电泳。用DNA 回收试剂盒对PCR产物进行回收。将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连结；将质粒转化进入大肠埃希菌Trans5α 感受态细胞，培养扩增；用质粒提取试剂盒提取质粒，置-20℃保存备用。

1.2.3实时荧光定量PCR 方法按下列组分配制Real-time PCR反应体系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL,GAPDH-F或HEV-F3(10 μmol/L)1 μL,GAPDH-R或HEV-R3(10 μmol/L)1 μL,模板2 μL,Rnase free water补足至20 μL。

将配制好的样品放在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中，按以下程序进行反应。95℃预变性30 s；95℃ 30 s，60℃5s，共35个循环；制备熔解曲线。

2结果

2.1临床表现

攻毒组ZCLA长爪沙鼠感染后部分出现精神萎靡，不爱活动，其中1只于攻毒后第3天死亡，病死率为 7%( 1/15) 。

2.2实时荧光定量PCR标准曲线的构建

用于制作定量标准曲线的标准品为含有GAPDH及HEV目的基因扩增片段的质粒pMD18-T，对样品进行1、10、100、1 000、10 000倍的梯度稀释，取5个点制作标准曲线(图1，图2)，GAPDH标准品扩增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-3.154-1=107.5%，相关系数R2=0.999，Y-inter=22.277；HEV目标基因扩增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-3.093=110.523%，相关系数R2=0.999，Y-inter=21.796。结果表明，这两个标准曲线的扩增效率相近，R2值都达到0.999，具有良好的重复性和精确性。

图1　GAPDH标准曲线

图2　HEV目标基因标准曲线

2.3Real-time PCR检测HEV载量

Real-time PCR 检测结果显示，肝脏、肠、胆汁、粪便、血液中均能检出HEV，阳性率达100%。从第3天就能在肝脏中检出HEV，其中第7天含量最高，约是第3天的6倍。肠持续带毒35 d，其中3 d～14 d病毒含量最高。第1周时胆汁中的病毒含量不断增加，第7天达到最高值，之后明显减少，持续带毒5周。粪便中的HEV含量相对其他组织较少，但持续排毒35 d，第7、14天时含量最高。血液中的病毒含量在第5、7天时达到最大值，之后明显减少，甚至检测不到病毒(表2)。

表2　各样品中HEV载量相对定量

3讨论

戊型肝炎的公共卫生意义越来越引起重视，但由于HEV在体外难以培养等原因，严重限制了本病毒在复制机理、致病性和跨种系传播等领域的深入研究。世界各国的许多科研人员都在探索感染模型或细胞培养技术，近年来HEV的细胞培养技术已取得一些突破性进展。已证实人胚肺二倍体传代细胞系、猪肝脏干细胞系、人肝癌细胞系和肺癌细胞系等均可用于HEV培养，其中以人肝癌细胞系PLC/PRF/5和肺癌细胞系A549最为高效[3]。对动物感染模型的研究表明，非人灵长类动物猕猴、黑猩猩、短尾猴等，猪、兔等家畜有望作为感染模型应用。其中猕猴、黑猩猩已被证明是较为理想的感染模型，但价格高、操作难和医学伦理等问题。猪、兔的成本相对较低，操作也简便，但存在仅感染特定的基因型、猪的实验操作存在一定难度，以及兔只对兔源HEV易感等局限。鼠类是医学研究中最理想的感染模型，但对大鼠、小鼠等进行的感染试验均以失败告终。我国科研人员发现长爪沙鼠能感染HEV，并观察到与猪等动物感染后相似的组织病理学表现[4]。不过，目前还没有人对病毒在组织器官中的分布、消长规律，免疫应答和抗体消长等进行研究。本研究在前期研究基础上，通过揭示长爪沙鼠感染HEV过程中各器官、组织中的病毒分布及载量的消长规律，为最终建立感染模型奠定了基础。

HEV感染后在宿主体内的增殖过程还不清楚。有研究结果表明，肝脏是HEV感染的主要靶器官。自然感染和人工感染的猪均可观察到肝脏有轻微损伤，并有病毒性肝炎的组织病理学表现[5]。此外，结肠、淋巴结、脾脏等其他组织器官中也能检测到病毒[6]。加拿大科研人员Leblanc D 等[7]研究发现，HEV感染猪在不同个体组织中的分布、病毒载量差异较大。在14头HEV阳性的屠宰猪中，病毒检出率以肝淋巴结最高(78.6%)，其他依次为胆囊(71.4%)、肝脏(64.2%)、胆汁(57.1%)、粪便(42.9%)、扁桃体(21.4%)和血浆(7.1%)，而肌肉中检测不到病毒。病毒载量以肝脏淋巴结、胆汁、肝脏中最高，在9.9×104-6拷贝/克之间。另有研究发现，人工感染的长爪沙鼠肠道黏膜上皮有大量病毒抗原分布，用HEV cDNA转染肠癌细胞系，ORF2及ORF3均在上皮细胞内表达，表明HEV感染对肠道黏膜免疫也有一定影响[8]。本研究发现肝脏、胆汁和肠的病毒载量最高，但感染后3 d即可检测到，证明长爪沙鼠对基因4型较为易感，病毒在组织器官中的分布与猪、猕猴等相同。此前已有研究表明长爪沙鼠对基因1型也易感[9]。不过，长爪沙鼠对2型、3型的易感染性有待确定。

HEV感染后，机体能成功启动体液免疫，产生的IgG、IgM具有病毒中和能力，但持续时间及再次感染过程中能发挥的作用还不清楚。此外，HEV感染后细胞免疫也发挥了重要作用。对急性肝炎患者细胞免疫应答的研究发现，CD4+T细胞群的总数增加。PBMCs中的IFN-γ在蛋白质和mRNA转录水平均提高。IL-2 和 TNF-α的水平没有变化。表明分泌IFN-γ的CD4+T细胞不属于Th1或Tp，并和NK细胞一样参与HEV致病过程[10]。对长爪沙鼠感染模型的研究也观察到类似的脑组织损伤，感染后第14天，脑组织神经元细胞呈散在变性坏死，血管周围有炎性细胞浸润，形成血管袖套，感染28 d时在大脑皮质可见有胶质结节形成等[11]。医学临床研究也发现，部分HEV感染患者神经系统也受到损害，表现吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome)、臂丛神经炎、急性横贯性脊髓炎、神经性肌肉萎缩，急性脑膜炎等[12]。

实时荧光定量PCR方法包括绝对定量和相对定量两种方法。绝对定量需要已知拷贝数的标准品构建标准曲线；相对定量是以表达恒定的内参基因为对照，获得目的基因表达量的变化。绝对定量能够获得目的基因准确的表达量，但不同样品需要不同的标准样品，操作繁琐[13]。此前HEV的检测主要用套式RT-PCR方法，但已逐渐被快速、特异、灵敏并能定量的实时荧光定量RT-PCR所取代。最先建立的是针对HEV 基因组ORF2 保守区域设计引物和探针，并且针对4个基因型的HEV 毒株。如王艳坤等[14]用人源HEV感染ZCLA长爪沙鼠，实时荧光定量PCR 测定结果，粪便中第7天可测到病毒，且排毒量最高，随后逐渐下降，排毒持续至35 d。此外，我国学者也从ORF3保守区设计引物和探针，建立了针对我国猪场普遍存在的猪基因4型的定量检测技术[15]。由于只检测IgM 和IgG 抗体对HEV 急性感染的早期无法做出诊断，实时荧光定量PCR在临床诊断中的应用越来越多。

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Study on Viral Dynamics in Gerbils Experimentally Infected with Hepatitis E Virus

YOU Hua1, ZHANG Jia2, LI Qing3, YAN Hong-ya2, SONG Chun-lian2,YIN Ge-fen2, SHU Xiang-hua2, LI Wen-gui2

(1.ChineseCenterForAnimalDiseaseControlAndPrevention,Beijing,100125,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China;3.SimaoAnimalHealthInspection,Puer,Yunnan,665000,China)

Abstract:In order to determine the viral dynamics during infection,in this study ZCLA Mongolia gerbils were experimentally infected with a genotype 4 strain isolated from Yunnan pig farms,and viral loads of HEV in blood,feces,livers and intestine tissues at different infection stages were determined by using real-time PCR.The results showed that HEV could be detected in all samples since 3 days post infection,high titers were found in intestines and biles.These results lay a good foundation for establishment of the HEV infection model,and further study of the correlation between the viral replication and the progress of disease,pathogenesis of hepatitis,prevention and control.

Key words:Hepatitis E virus;experimental infection model;virus dynamics;ZCLA Mongolia gerbils

文章编号:1007-5038(2016)03-0010-05

中图分类号:S852.651；S852.659.6

文献标识码:A

作者简介：尤华(1976-)，女，江苏海安人，高级兽医师，主要从事兽医公共卫生研究管理工作。*通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(31160495)

收稿日期：2015-09-10