猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立

罗忠永，王　印，杨泽晓

(四川农业大学动物医学院动物检疫实验室，四川成都 611130)



研究论文

猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立

罗忠永，王印*，杨泽晓

(四川农业大学动物医学院动物检疫实验室，四川成都 611130)

摘要：应用通用反转录试剂盒和环介导等温核酸扩增技术(LAMP)建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法，同时评价了该检测方法的特异性、稳定性和灵敏度。结果表明，根据猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因保守区设计的LAMP引物能够在64.5℃ 60 min内实现对目标核酸片段的大量扩增，检测结果可通过直接观察反应副产物(焦磷酸镁)进行判读，该检测系统具有很高的特异性，与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒等均无交叉反应；通过PRRSV不同毒株疫苗、模拟样品和临床样品确定，该检测系统具有很好的稳定性；通过质粒确定该检测系统可以检测到10 拷贝/μL的病毒核酸模板。结果表明成功建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP快速检测方法，为临床提供了一种很好的检测手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；环介导等温核酸扩增；检测

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)也称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，也称猪蓝耳病病毒)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。该病1987年首次在美国发生，随后迅速在世界大范围流行[1]。我国自1996年报道以来，该病已遍及全国各地，成为危害养猪业最严重的疫病之一[2-4]。2006年夏秋季节，我国南方部分省份相继暴发“猪高热病”疫情，诊断该病主要病原为高致病性猪蓝耳病病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，该病半年内几乎传遍了大半个中国，造成大批猪只死亡，引起巨大的经济损失[5]。PRRSV是一种表面相对光滑并且有囊膜的病毒，其直径大小约50 nm～65 nm，属于套式病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉病毒属(Arterivirus)[6]。根据PRRSV抗原性、遗传特性和致病性将其分为两个基因型，即欧洲Ⅰ型和美洲Ⅱ型，有研究表明美洲Ⅱ型是由欧洲Ⅰ型隔离变异而来[7]。PRRSV为单股正链不分节段的RNA病毒，基因组大小约为15 kb，结构为5′-UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-UTR-poly(A)-3′，共含有10个开放性阅读框(ORFs)[8]。HP-PRRSV属于美洲型，基因组结构与经典的PRRSV有所不同，其Nsp2基因有两处不连续的缺失，一处缺失3 nt，另一处缺失87 nt；氨基酸水平缺失30 aa[9]。病毒蛋白的表达机制是位于基因组3′端的结构基因通过负链不连续转录机制进行亚基因的转录，产生6个亚基因组mRNA表达蛋白[10]。亚基因组结构mRNAs具有与基因组相同的5′-UTR、3′-UTR、poly(A)尾巴[11]。ORF1a和ORF1b两个开放性阅读框长度约占基因组全长的80%，分别编码多聚蛋白pp1a和pp1ab，然后分别被裂解为9种和4种非结构蛋白[12]。ORF2-7分别编码病毒结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[13]。主要结构蛋白为GP5、M和N蛋白。M蛋白是非糖基化的囊膜蛋白，分子质量约为18 ku～19 ku，是所有毒株中最保守的结构蛋白，M蛋白不仅能刺激机体产生中和抗体，也可刺激产生最强的T淋巴细胞免疫应答，在细胞免疫中起着重要作用[14]。

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研化学株式会社独立研发的一种简便、快速、准确、廉价的核酸扩增方法[15]。环介导等温核酸扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4个不同的引物，然后再利用链置换反应在一定的温度下(60℃～65℃)、经一个步骤即可完成[16]。扩增效率极高，可在15 min～60 min内实现109～1010倍的扩增[17]，且有高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶序列的存在与否做出判断[18]。基于此，本研究选择M蛋白基因的保守序列设计引物，建立了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的LAMP方法。

1材料与方法

1.1材料

猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒疫苗均为市售产品；猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性病料(农业部推荐RT-PCR检疫标准验证)，本实验室保存；PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)、DdeⅠ内切酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；BstDNA聚合酶、大片段，NEB(北京)有限公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计从GenBank下载PRRSV美洲型和欧洲型参考毒株的M蛋白基因序列或从全基因组序列中找出M蛋白基因序列，利用 DNA Star5.0软件分析M蛋白基因序列中的保守片段，利用PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计LAMP扩增PRRSV M蛋白部分核酸序列的引物；利用在线引物设计软件(http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer)设计用于构建LAMP扩增质粒模板的引物。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，PAGE纯化。引物信息见表1。使用酶切位点在线分线软件(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)分析筛选用于检验LAMP反应的内切酶。

表1　猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测引物和质粒模板构建引物

1.2.2质粒模板构建使用宝生物工程(大连)有限公司RNAiso Plus提取PRRSV疫苗核酸，使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)反转录试剂盒合成cDNA；使用天根生化科技(北京)有限公司2×Pfu PCR MaserMix扩增M蛋白部分序列，50 μL反应体系；PCR 扩增后取5 μL 10 g/L琼脂糖凝胶确认正确扩增后，剩余45 μL用8 g/L琼脂糖凝胶分离，通用型DNA纯化回收试剂盒回收目的片段；使用加A反应液对纯化后的平末端加A用于TA克隆，20 μL反应体系；加A后产物直接用于连接T-Vector pMDTM19(Simple)，反应体系10 μL(模板与载体的摩尔比3∶1～5∶1)，连接产物直接转化大肠埃希菌Dpα感受态细胞，蓝白斑筛选挑取白色菌落过夜培养用质粒小提取试剂盒提取质粒，用Thermo NANODROP 2000分光光度计测量核酸浓度，并将标准质粒送交英潍捷基(上海)贸易有限公司进行双向测序。测序引物：M13 primer F(CAGGAAACAGCTATGAC)和M13 primer R(GTTTTCCCAGTCACGA)。

1.2.3猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立LAMP反应体系为25 μL ,即10×ThermoPol缓冲液2.5 μL,MgSO4(100 mmol/L)1.5 μL,dNTP混合液(10 mmol/L) 3.5 μL,FIP/BIP(40 μmol/L)1 μL,F3/B3(5 μmol/L)1 μL,BstDNA聚合酶，大片段(8 000 U/mL)1 μL，DNA模板2 μL,Betaine(4 mol/L)5 μL,无核酸酶水5.5 μL。反应条件为64.5℃恒温60 min。反应产物用DdeⅠ内切酶验证。反应优化，夹逼法[19]60℃～68℃摸索反应体系的最适反应温度。

1.2.4特异性检验用猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒检验检测体系的特异性，加入PRRSV疫苗作为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照；阳性对照产物使用DdeⅠ内切酶验证。

1.2.5稳定性检验使用PRRSV不同毒株或不同来源疫苗，模拟样品(参考文献[19])，临床样品(阳性病料，农业部推荐RT-PCR检疫标准验证)对检测体系的稳定性进行验证，无核酸酶水作为阴性对照；随机挑取阳性产物使用DdeⅠ内切酶验证。

1.2.6灵敏度检验使用1.2.2建立的质粒模板，10倍梯度稀释100拷贝/μL～104拷贝/μL，检验检测体系的灵敏度，无核酸酶水作为阴性对照；阳性产物使用DdeⅠ内切酶验证。

2结果

2.1猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立与反应优化

参照夹逼法[20]原理依据引物的退火温度选择60℃和65℃两个温度，结果65℃产物可见明显的浑浊，产物经30 g/L琼脂糖凝胶电泳可见与设计相符的梯状电泳条带，哑铃状条带出现在双链50 bp～100 bp之间，与设计相符；产物经DdeⅠ内切酶酶切验证。推测反应体系最适温度在65℃左右，选择63℃和68℃两个温度，结果63℃产物可见明显的浑浊，琼脂糖电泳及酶切验证。推测反应体系最适温度在63℃～65℃之间，通过PCR仪在63℃～65℃之间设置8个温度梯度，最终确定64.5℃为反应体系最适温度(图1)。

M.DNA 标准DL 500;NC.阴性对照；1.63℃；2.63.2℃；3.63.6℃；4.63.9℃；5.64.2℃；6.64.5℃；7.65℃

M.DNA Marker DL 500;NC.Negative control；1.63℃；2.63.2℃；3.63.6℃；4.63.9℃；5.64.2℃；6.64.5℃；7.65℃

图1温度优化

Fig.1Temperature optimization

2.2特异性检验

用猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒检验检测体系的特异性，结果仅阳性对照结果出现明显的浑浊，30 g/L琼脂糖凝胶电泳和DdeⅠ内切酶酶切验证阳性扩增(图2)。

2.3稳定性检验

使用PRRSV不同毒株或不同来源疫苗，模拟样品，临床样品(阳性病料，农业部推荐RT-PCR检疫标准验证)对检测体系的稳定性进行验证，结果猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗7株不同毒株或不同来源疫苗扩增结果均为阳性(图3)，模拟样品(200 μL正常组织研磨液中加入2 μL质粒模版)阳性，临床样品24份中仅1份为阴性，与农业部推荐检疫标准符合率为95.8%，阴性对照未出现扩增，随机挑取2份阳性产物使用DdeⅠ内切酶酶切证明扩增正确(图4)。

2.4灵敏度检验

利用质粒模板，10倍梯度稀释在100拷贝/μL～104拷贝/μL，检验检测体系的灵敏度，结果显示101拷贝/μL时,产物可见较为明显的浑浊，30 g/L琼脂糖凝胶电泳条带明亮清晰，100拷贝/μL时产物无肉眼可见的明显浑浊，30 g/L琼脂糖凝胶电泳条带极为不清晰，部分条带缺失；阴性对照未出现扩增，101拷贝/μL阳性产物使用DdeⅠ内切酶酶切证明扩增正确(图5)。

M.DNA 标准DL 500;PC.阳性对照；NC.阴性对照；1.猪圆环病毒2型;2.猪伪狂犬病病毒;3.猪细小病毒;4.猪乙型脑炎病毒;5.猪瘟病毒

M.DNA Marker DL 500;PC.Positive control；NC.Negative control；1.PCV-2；2.PRV；3.PPV；4.JEV；5.CSFV

图2特异性检验

Fig.2Specificty test

M.DNA 标准DL 500;1.HuN4-F112 株；2.CH-1R 株；3.R98株；4.CH-1R 株；5.JXA1-R 株；6.CH-1R 株；7.JXA1-R株；NC.阴性对照

M.DNA Marker DL 500;1.HuN4-F112 strain；2.CH-1R strain；3.R98 strain；4.CH-1R strain；5.JXA1-R strain；6.CH-1R strain；7.JXA1-R strain；NC.Negative control

图3稳定性检验

Fig.3Stability test

M.DNA 标准DL 500;1～24.临床阳性样品

M.DNA Marker DL 500;1-24.Positive clinical samples

图4符合率检验

Fig.4Compliance rate test

M.DNA 标准DL 500;9～0.109拷贝/μL～100拷贝/μL

M.DNA Marker DL 500;9-0.109copies/μL-100copies/μL

图5灵敏度检验

Fig.5Sensitivity test

3讨论

本检测反应体系参考荣研生物科技(中国)有限公司生产的 Loopamp DNA扩增试剂盒(货号SLP204/SLP206 )和其他学者的研究成果[21-23]，未对Mg2+浓度、BstDNA聚合酶酶量等进行优化，仅对反应温度进行了优化，结果显示，该检测反应体系具有很好的适应范围，在63℃～65℃之间均有明显的扩增；选取64.5℃作为反应温度是对反应产物浑浊度、琼脂糖凝胶电泳清晰度、引物二聚体量等综合考量后做出的优化。没有优化反应时间，检测体系并未加入LoopF/R引物是参考了其他研究者的研究结果[16]，避免非特异性产物的产生。

本次选取不同毒株或不同来源的猪瘟病毒疫苗7株、猪乙型脑炎病毒疫苗1株、猪细小病毒疫苗5株、猪圆环病毒2型疫苗5株、猪伪狂犬病病毒疫苗7株，对该检测反应体系特异性进行检验，确保检测体系特异性；同时通过不同毒株或不同来源的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗共6株，包括HuN4-F112株、CH-1R株、R98株、JXA1-R株和模拟阳性样品，临床样品对检测反应体系的稳定性进行检验。特别是对24份保存的农业部推荐的RT-PCR检疫标准鉴定为阳性临床样品的检测，两者的符合率高达95.8%，保证本检测体系检测结果的可信度，对本检测方法的推广应用奠定了基础。

LAMP的核心是利用链置换型DNA聚合酶形成如同哑铃状的结构，此结构是环介导等温扩增法扩增循环的起始结构。本研究发现LAMP反应体系建立的难点在于引物设计，引物设计的难易取决于扩增序列的选择。寻找特异保守的扩增序列是整个试验的关键，笔者在对PRRSV核酸序列研究中发现PRRSV M蛋白基因较为保守[4，11-14]，依据M蛋白核酸序列设计的引物具有很好的检出率和特异性，推测M蛋白核酸序列还具有核酸提取过程中不易断裂的特性，是PRRSV核酸检测很好的靶基因序列。同时本试验还有一个难点是引物量的使用，本试验在前期预试验时发现加入LoopF/R引物会形成较多的引物二聚体，因此参考其他研究者的做法[16]，本试验中未加入LoopF/R引物；由于没有找到可行的FIP/BIP、F3/B3的使用量及比例优化方案，尽管在综合考虑引物二聚体量后对反应温度进行了优化，但反应产物琼脂糖凝胶电泳仍可见明显的引物二聚体结构，因此仍需在更深入的研究基础上对反应体系进行优化。

我国自1996年报道PRRS以来，已遍及全国各地，成为危害养猪业最严重的疫病之一[2-4]。对PRRSV的快速准确检测是控制PRRS传播重要措施。本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒M 蛋白基因保守区设计的LAMP引物能够在64.5℃、60 min内实现对目标核酸片段的大量扩增，反应仅需一个恒温水浴锅，检测结果可通过直接观察反应副产物(焦磷酸镁)判断，该检测系统具有极高的特异性和稳定性；与农业部推荐检疫标准符合率高达95.8%，为猪繁殖与呼吸综合征病毒提供了一个快速简便的检测方法。

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Development of a LAMP Method for PRRSV

LUO Zhong-yong，WANG Yin，YANG Ze-xiao

(AnimalQuarantineLaboratory,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Chengdu,Sichuan,611130,China)

Abstract:A rapid detection method for porcine reproductive and respiratory syndrome virus was established by using the universal reverse transcription kit and loop-mediated isothermal amplification technology,and the specificity,stability,sensitivity of the detection were evaluated.The results showed that the target nucleic acid fragment can be amplified in 64.5℃ within 60 min using the LAMP primers designed according to porcine reproductive and respiratory syndrome virus M protein gene conservative region,the test results can be directly observed by the naked eye through the reaction-products (magnesium pyrophosphate),the detection system has high specificity,and viruses such as classical swine fever virus,porcine Japanese encephalitis virus showed no cross reaction;the good stability of the detection system was confirmed by different strains of vaccines,simulated samples and clinical samples;the plasmid-template which is just 10 copies/μL in concentration was detected by the detection system.The test results proved that the LAMP method of rapid detection for porcine reproductive and respiratory syndrome virus was successfully established.

Key words:PRRSV;LAMP;detection

文章编号:1007-5038(2016)03-0001-05

中图分类号:S852.659.6

文献标识码:A

作者简介：罗忠永(1992-)，男，河南潢川县人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。*通讯作者

基金项目：“十二五”国家科技支持计划项目(2013BAD12B04)

收稿日期：2015-10-05