骨质疏松患者外周血Th17细胞比例变化及其与血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平的相关性

罗干，李广，张超，孙天威

(1 天津医科大学研究生院，天津300070；2 天津市人民医院)



骨质疏松患者外周血Th17细胞比例变化及其与血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平的相关性

罗干1,2，李广1,2，张超1,2，孙天威2

(1 天津医科大学研究生院，天津300070；2 天津市人民医院)

目的 观察骨质疏松(OP)患者外周血辅助性T细胞(Th)中辅助性T细胞17(Th17)比例变化，并分析其与血清白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)、白介素6(IL-6)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)水平的相关性。方法 选择52例OP患者为观察组，56例健康体检者为对照组，抽取两组空腹外周静脉血，采用流式细胞术测算两组外周血Th(CD4+T细胞)中Th17比例，采用ELISA法检测两组血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL。采用Spearman相关性分析法分析外周血Th17细胞比例与IL-17、IL-23、IL-6、RANKL的相关性。结果 观察组、对照组外周血Th中Th17比例分别为2.77%±0.93%、1.32%±0.42%，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清IL-17分别为(145.89±44.23)、(108.99±32.83)pg/mL ，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清IL-23分别为(33.98±12.33)、(16.55±6.78)pg/mL，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清IL-6分别为(84.98±45.98)、(23.98±9.88)pg/mL，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清RANKL分别为(0.16±0.05)、(0.12±0.04) μg/L，两组比较，P<0.05。Spearman相关性分析发现，OP患者外周血Th中Th17比例与IL-17、IL-23、IL-6、RANKL均呈正相关(r分别为0.362、 0.347、0.122、0.875，P均<0.05)。结论 OP患者外周血Th中Th17比例升高，血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平升高。Th17可能通过升高IL-17、IL-23、IL-6、RANKL参与OP的骨代谢失衡过程。

骨质疏松；辅助性T细胞；白细胞介素；核因子-κB受体活化因子配体

骨质疏松(OP)是全身多系统骨骼疾病，主要表现为骨小梁减少、坍塌，骨密度降低，骨脆性增加等[1]。OP的发病机制主要与炎症、免疫、遗传等因素相关[2,3]。辅助性T细胞17(Th17)因主要分泌IL-17而得名，其与自身免疫性、炎症性疾病的发病密切相关[4]。IL-17、IL-23、IL-6、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)是Th17分泌的主要细胞因子，参与人体破骨作用。但国内外关于Th17在OP发病机制中发挥作用的报道却存在差异。本研究观察了OP患者外周血Th17细胞比例变化，并分析其与血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平的相关性。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年12月～2016年3月天津市人民医院骨科收治的OP患者52例，其中男20例、女32例，年龄45～75(60±12)岁，骨密度(BMD)为3.06±1.9 ,白细胞为(5.06±2.9)×109/L，AST为(32.53±23.64) g/L，ALT为(27.55±21.23) g/L，Hb为(145±16) g/L，Glu为(5.09±0.80) mmol/L，HDL-C为(1.45±0.36) mg/dL，LDL-C为(2.83±0.67) mg/dL ，载脂蛋白A1为 (1.35±0.16) g/L；均符合中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会制定的原发性骨质疏松诊断标准[5]。纳入标准：原发性骨质疏松患者，无其他并发疾病者。排除标准：存在除骨质疏松外其他代谢疾病或影响骨代谢的疾病者；排除患有严重的慢性疾病者；排除恶性肿瘤患者；排除存在影响骨代谢药物史者。另选择56例同期天津市人民医院门诊就诊的BMD正常患者为对照组，其中男22例、女34例，年龄43～73(60±11)岁，BMD为 0.72±1.2。两组年龄、性别比例等具有可比性。本研究经天津市人民医院伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。

1.2 两组外周血Th中Th17比例检测 抽取两组空腹外周血3 mL,抗凝，采用流式细胞仪和流式细胞术检测两组外周血Th中Th17比例：取500 μL全血加入500 μL 含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，加入刺激阻断剂Cell Stimulation Cocktail 2 μL后充分混匀，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育5 h。再次混匀取50 μL孵育后全血转移至流式细胞管中，加入胞外抗体CD3-PE 5 μL,4 ℃避光反应20 min;加入300 μL破膜固定液避光反应20 min;加入CD4-FITC 5 μL、藻红蛋白Cy5- IL-17A 5 μL，4 ℃避光反应20 min；洗涤后加入PBS 500 μL待测。用流式细胞仪检测并用Flowjo7.6软件计算Th17占总T细胞(CD4+T细胞)的比例。实验重复3次，取平均值。

1.3 两组血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL检测 抽取两组空腹外周血3 mL,采用ELISA法检测两组血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL。所有操作均严格按照使用说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验。变量间的相关关系采用Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组、对照组外周血Th中Th17比例分别为2.77%±0.93%、1.32%±0.42%，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清IL-17分别为(145.89±44.23)、(108.99±32.83)pg/mL，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清IL-23分别为(33.98±12.33)、(16.55±6.78)pg/mL，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清IL-6分别为(84.98±45.98)、(23.98±9.88)pg/mL，两组比较，P<0.05。观察组、对照组血清RANKL分别为(0.16±0.05)、(0.12±0.04)μg/L，两组比较，P<0.05。Spearman相关性分析发现，OP患者外周血Th17细胞比例与IL-17、IL-23、IL-6、RANKL均呈正相关(r分别为0.362、 0.347、0.122、 0.875，P均<0.05)。

3 讨论

Th17细胞因主要分泌IL-17而得名，是T细胞的一个特殊亚群。IL-17在小鼠胶原诱导的关节炎动物模型中可促进骨丢失[6]。进一步研究发现，在类风湿性关节炎的小鼠模型中阻断IL-17的作用可显著的减少骨质破坏[7]。这些结果表明，Th17细胞可能参与了OP的发病机制。有研究发现，健康成年人群年龄每增加1岁骨量相应下降1%，该现象在绝经期及绝经后女性尤其显著，其每年骨丢失量甚至可以达到2%～5%，小梁骨丢失较皮质骨丢失快，这一过程大概持续10～15年，此后的骨量丢失逐渐趋于平稳[8]。Tyagi等[9]的研究显示，雌激素缺乏可诱导Th17细胞的分化，可能作为OP发病的一种新的机制。绝经期女性往往雌激素迅速下降，可推测绝经期女性的OP可能跟雌激素降低有关。普遍认为，造成OP的主要因素是骨代谢失衡，骨代谢主要包括破骨细胞吸收旧骨质同时由成骨细胞合成新骨加以代替的过程。破骨细胞和成骨细胞是骨代谢最小的功能单位，他们之间的平衡关系决定了OP与否，在生长发育期新骨生成大于破骨的效应，使得骨骼生长；在骨峰值期的时候新骨生成等于破骨效应，此时破骨效应与新骨生成处于一个相对平衡的状态；OP患者往往破骨效应大于新骨生成，导致骨质大量流失[10]。成骨细胞和破骨细胞之间的平衡关系在骨代谢相关性疾病的发生发展中起到了至关重要的作用[11]。本研究结果显示，观察组Th中Th17比例及血清IL-17显著高于对照组，与Molmar等[12]研究结果一致。有研究报道，在动物模型中，TGF-β、IL-6、IL-23联合诱导Th17细胞分化和成熟，IL-6对激活信号转导与转录因子3有重要作用，能促进Th17分化和扩增过程[13，14]。Annunziato等[15]研究认为IL-23可以部分限制细胞融合和破骨细胞的存活。此外，在Th17细胞可以在RANKL和非分泌型巨噬细胞集落刺激因子的刺激下显著增加破骨细胞的形成[6]。也有研究认为Th17细胞不仅可以直接产生RANKL[16,17]，而且还可以刺激成骨细胞的分泌RANKL，同时在成骨细胞与骨髓细胞共同培养条件下能够诱导破骨细胞的分化[18]。Schuarz等[19]进一步发现IL-17即使在没有RANKL存在的情况下，也可以直接刺激外周血单核细胞形成破骨细胞，并促进破骨细胞成熟时出现的肌动蛋白环的形成。RANKL是破骨细胞吸收的终末效应分子[20]。而Th17细胞可高表达RANKL，RANKL作用于破骨细胞前体诱导破骨[20]。本研究显示，观察组外周血Th中Th17比例显著高于对照组，血清RANKL也显著高于对照组，且外周血Th中Th17比例与血清RANKL表达水平呈正相关。该结果说明Th17增加，诱导大量的RANKL生成，而RANKL可进一步诱导破骨细胞生成增多，使得骨代谢平衡失衡，破骨效应远远大于成骨效应，从而进一步加重骨小梁破坏、骨量减少，最终导致OP。本研究还显示，观察组IL-17水平显著高于对照组，且IL-17与外周血Th中Th17比例呈正相关。说明IL-17也参与了破骨细胞的分化。血清IL-6、IL-23水平与外周血Th中Th17比例也呈正相关，说明IL-23、IL-6、IL-17共同存在进一步诱导初始T细胞向Th17细胞分化，使得IL-17大量产生，从而形成一个链式效应，使破骨效应持续，OP进一步加重。

综上所述，OP患者外周血Th中Th17比例升高，血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平升高。Th17可能通过升高IL-17、IL-23、IL-6、RANKL参与OP的骨代谢失衡过程。

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孙天威(E-mail: billsuntw@163.com)

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B

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2016-06-02)