RNA干扰大肠癌相关信号通路基因表达的研究进展

刘莲花，刘模荣，董辉，金海，文国荣，徐靖宇(遵义医学院附属医院，贵州遵义563000)



·综述·

RNA干扰大肠癌相关信号通路基因表达的研究进展

刘莲花，刘模荣，董辉，金海，文国荣，徐靖宇(遵义医学院附属医院，贵州遵义563000)

摘要：基因沉默指外源性基因在细胞内不表达或低表达状态。RNA干扰属于转录后基因沉默，在基因功能研究上，RNA干扰已成为最强大的基因剔除遗传工具。近年来，对与大肠癌发生发展有关的相关信号通路研究日益增多，其中wnt/β-catenin、STATS信号通路、TGF-β/Smads信号转导通路、RAS/MARK信号转导通路、磷脂腺激醇3-激酶等信号通路的异常改变在大肠癌发生及发展中最常见。RNAi有高效性及特异性的特点，在肿瘤治疗中广泛应用。RNAi对大肠癌细胞的作用包括靶向预制外源基因和内源基因。通过大肠癌细胞生长分化相关信号转导通路多个基因的共同序列抑制多个基因表达，并通过干扰细胞信号转导通路中关键蛋白的表达，从而达到预制大肠癌细胞的生长。

关键词：大肠癌；基因沉默；RNA干扰；信号转导通路

2014年美国癌症学会统计数据显示，大肠癌已成为全球仅次于乳腺癌和肺癌最常见的恶性肿瘤之一，其发病率因地区不同而存在较大差异[1]。因大肠癌早期无明显特异性临床症状及体征，多数患者就诊时已处于中晚期，目前主要采取手术治疗为主、放化疗为辅的治疗方式，有远处转移的大肠癌治疗效果及预后均不佳[2]。随着分子生物学及基因工程的发展，RNA干扰(RNAi)作为一种生物分子技术在肿瘤疾病治疗领域得到重视。研究表明降低肿瘤的发生率，提高癌症治疗效果及改善癌症患者生存率可通过RNAi及有效敲除肿瘤基因的表达得以实现[3]，因此进一步寻找新的治疗靶点已成为提高大肠癌患者生存率及改变其生存率的重点问题。

1RNAi的研究背景及作用机制

基因沉默是调控真核生物细胞基因表达的手段，指因外源基因在转基因植物和转基因动物体细胞内并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。RNAi属于转录后基因沉默，RNAi主要作用机制是基因表达的相应mRNA被小片段双链RNA(dsRNA)高效特异性降解,从而特异性阻断相应基因表达[4]。研究者于1995年在对线虫的试验中发现正义RNA与反义RNA均可阻断par-1表达，称为RNAi。Fire等证明RNAi属于转录后水平的基因沉默，之后RNAi在植物及哺乳动物体内相继被发现。RNAi是由特定小RNA介导的转录后基因沉默，其中小RNA包括内源性微小RNA(micRNA)、外源性小干扰RNA(siRNA)或短发卡RNA(shRNA)[5]，根据靶dsRNA的合成方法将RNAi技术分为体外化学合成法、体外转录法、体内载体合成法三种。近年来，在基因功能研究上，RNAi已成为最广泛及最强大的基因剔除工具，成为肿瘤相关疾病的治疗热点。RNAi具有高效性和特异性的特点，成为大肠癌基因治疗研究领域的新方法。RNAi技术中特异性的siRNA载体分两类：①病毒siRNA表达载体，如慢病毒、腺病毒、反转录病毒等。②siRNA质粒表达载体或阳离子脂质体包裹的siRNA。因siRNA质粒表达载体的转染效率低及阳离子脂质体包裹的siRNA具有细胞毒性，而病毒siRNA 表达载体因有较低的免疫原性及细胞毒性，已成为基因治疗研究领域的理想工具。有研究证实RANi的作用机制可能与部分酶和蛋白有关，如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、dsRNA 特异性核酸内切酶(Dicer)、Argonaute 蛋白等。通过研究这些酶与蛋白在细胞基因表达及调控机制，进一步阐明RNAi可能的作用机制与RNA诱导的沉默复合体(RISC)有关：①RISC是由siRNA与核酸内外切酶、解旋酶、ATP、 Argonaute蛋白连接在一起形成有多个亚单元沉默复合体。通过转染技术将dsRNA转染入细胞内，较长的dsRNA在细胞体内通过Dicer的RNA酶Ⅲ样特异性核酸内切酶切割，产生21～23 nt 的siRNA，5′-磷酸和3′-羟基分别分布于siRNA两条单链末端，且 3′端均有2～3个突出的核苷酸，能与其他蛋白质及酶结合 形成RISC。RISC中的降解酶应用ATP解开siRNA双链，使靶向的mRNA上与之相匹配的特异性序列与解开的siRNA 反义互补结合，RISC中的核酸降解靶细胞中的mRNA，从而使目的基因沉默，即产生RNAi现象。②siRNA亦可与RISC和mRNA结合在一起，在siRNA双链被接开后，反义RNA链以 mRNA 为模板作为双链 RNA 合成的一个引物，在RdRP作用下形成新的dsRNA ,再次被 Dicer 识别并切割,形成新的siRNA 再循环，这样不断放大的作用形式能作用于其他更多的靶向mRNA，使siRNA在短时间内快速并有效抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。

目前RNA干扰存在的问题：①在构建siRNA序列过程中，如何找到效果最好的siRNA序列。②如何提高所构建的特异性siRNA转染效率。③如何解决外源性的siRNA在体内产生的免疫反应及拮抗效应[6]。④如何减少siRNA在体内的脱靶效应等。

2影响大肠癌发生的相关信号转导通路

大肠癌相关信号通路的异常与大肠癌的发生及发展密切相关。影响大肠癌的相关信号通路有Wnt/β-catenin信号转导通路、STATS信号通路、TGF-β/Smads信号通路、RAS/MARK信号通路、丝裂原蛋白激酶信号通路(ERK-MAPK信号通路)、mTOR信号通路、TGF-β/Smad4信号通路、水通道蛋白-5(AQP-5)、凋亡及细胞核因子-κBp65(NF-κB p65)信号通路、磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)信号通路、钙离子信号通路、MAPKs/NF-1κB信号转导、hedgehog信号通路、BMP7-Ids信号通路等。其中wnt/β-catenin、STATS信号通路、TGF-β/Smads信号转导通路、RAS/MARK信号转导通路、磷脂腺激醇3-激酶等信号通路的异常改变在大肠癌发生及发展中最常见。RNAi有高效性及特异性的特点，在肿瘤治疗中广泛应用。RNAi对大肠癌细胞的作用包括靶向预制外源基因和内源基因。通过大肠癌细胞生长分化相关信号转导通路多个基因的共同序列抑制多个基因表达，并通过干扰细胞信号转导通路中关键蛋白的表达，从而达到抑制大肠癌细胞的生长[7，8]。

3RNA干扰Wnt/β-catenin信号转导通路基因表达

Wnt/β-catenin是肿瘤细胞发生过程中关键的信号通路之一，尤其在大肠癌细胞生长、迁移及分化中起重要作用。其通过稳定β-catenin蛋白[9]，从而促进基因表达及细胞增殖。调节Wnt/β-catenin通路的关键蛋白如Axin2、APC及β-catenin的异常改变，使Wnt/β-catenin不能被磷酸化及降解，Wnt/β-catenin在大肠癌细胞中大量聚集并进入细胞核与TCF-LEF结合调节肿瘤细胞的增殖，使该通路在无Wnt刺激的状态下仍能处于激活状态，从而激活相应基因转录且对肿瘤细胞的侵袭及转移起促进作用。抗凋亡蛋白bcr与β-catenin结合形成复合物，通过负向调节β-catenin激活的转录基因，促进肿瘤细胞的生长。有学者通过构建β-catenin的siRNA转染到大肠癌细胞HCT166和SW480中，后通过相关试验技术检测出被siRNA感染的大肠癌细胞HCT166和SW480分别存在β-catenin和APC突变，结果发现转染siRNA后的两株大肠癌细胞中β-catenin和β-catenin相关基因的表达显著降低，且癌细胞增殖明显受抑[10,11]。Ressd等通过将bcr的siRNA敲出基因转染到大肠癌HCT-166细胞株内，激活了转录基因c-myc表达，证实bcr在Wnt信号通路中可作为肿瘤抑制基因。

4RNA干扰PI3K/AKT信号转导通路基因表达

PI3K/AKT信号转导通路在大肠癌细胞恶性增殖、转移及血管新生中起重要作用，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是由一个催化亚基p110h和一个调节亚基p85构成。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。已有研究表明，p85和Akt2在大肠癌腺体中呈高表达。在正常细胞中，抑癌基因PTEN可抑制PI3K/AKT信号转导通路，但在大肠癌细胞中PTEN表达下降，使PI3K/AKT信号转导通路的抑制受限，从而导致大肠癌细胞的增殖和侵袭能力得不到很好的控制。Rychahou等分别用p110和p85的siRNA转染至人大肠癌KM20和HT-29细胞株中，发现癌细胞凋亡增加及增殖能力下降。

5RNA干扰TGF-β/Smads信号转导通路基因表达

TGF-β/Smads信号转导通路为TGF-β经典的信号转导通路，与大肠癌细胞的增殖、分化、转移及凋亡密切相关。TGF-β即转换生长因子β，是生长因子超家族中的一种，近期研究表明TGF-β1可通过抑制大肠肿瘤对免疫细胞的渗透作用逃脱机体的免疫监视而促进肿瘤形成[12]。TGF-β1也可调节血管的生成从而促进大肠癌细胞的增殖和侵袭。TGF-β对大肠癌细胞的增生或凋亡作用决定癌细胞的变异情况。Smads复合物通过与不同的DNA结合蛋白或共转录因子相互作用，Smads的变异可促进大肠癌细胞转移，其中Smad4蛋白是该信号通路的关键蛋白，其变异可使TGF-β/Smad转变成促进肿瘤细胞生长的信号转导通路[13]。通过构建Smad4-shRNA表达质粒转染至大肠癌细胞HCT-166细胞中，Smad4基因沉默后转染的细胞增殖力及侵袭能力明显增强，早期凋亡率明显降低，S期细胞增多，且Smad4基因可能与大肠癌细胞侵袭转移关系密切。

6RNA干扰 STAT信号转导通路基因表达

STAT信号转导通路即信息转导和转录激活因子，其中STAT-6、STAT-3均属于信息转导和转录激活因子家族的重要成员[14]。STAT是生长因子、细胞因子及非受体酪氨酸激酶等多个致癌性酪氨酸激酶的汇集焦点，该信号通路的过度激活使其下游靶基因的调节异常，从而使大肠癌细胞增殖、分化和凋亡产生异常，导致肿瘤形成。STAT6信号通路可通过抑制肿瘤细胞的凋亡从而促进肿瘤细胞的发展。张明生等通过沉默STAT6特异性基因，构建Sh质粒转染到人大肠癌HT-29细胞株中，从而阻断STAT6信号通路的传导，后试验证明被转染过STAT6特异性shRNA的大肠癌细胞中Bcl-2基因表达明显减少，Bax蛋白基因增多，癌凋亡明显增加[15]。Qian等[16]通过构建针对STAT3基因的shRNA表达载体,转染到体外培养人结肠癌HT-29细胞中，试验证实通过特异性沉默STAT3基因表达,可有效地抑制大肠癌细胞增殖，并使结肠癌细胞阻滞于G0、G1期并诱导其凋亡，癌细胞侵袭能力明显降低。

7RNA干扰RAS/MAPK信号转导通路基因表达

RAS蛋白包括K-RAS、N-RAS及H-RAS，多数大肠癌中均有K-RAS变异[17]，其中主要表现为B-RAF及K-RAS变异,导致GTP不能水解[18]，使RAS-GTP处于持续活化状态，从而导致RAS/MAPK信号通路活性增强，最终激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK，从而促进大肠癌的发生和发展。研究者通过Rac1-shRNA载体质粒并转染到结直肠细胞株(LoVo、SW480、SW620、SW1116、HT29)，后试验表明以上被转染特异性Rac1-shRNA大肠癌细胞侵袭移动能力受到抑制，癌细胞中Rac1蛋白不表达,细胞周期进程受抑制,阻滞于G0、G1期，细胞凋亡明显增加。

8RNA干扰新型钙离子转导通路基因表达

瞬时性受体电位通道(TRP)超家族中，TRPV是其超家族中的重要成员之一，其中TRPV5、TRPV6是TRPV中惟一已知钙离子高选择性通道，在有钙离子跨膜转运功能的器官中表达，其中主要表达于前列腺、乳腺、肾脏、小肠上皮等器官中，而人结肠癌细胞株(Sw480)中亦有表达，TRPV6表达高于TRPV5表达，在早期结肠癌中TRPV6有66%过表达[19]。有研究认为钙缺乏可促进TRPV6在小鼠十二指肠黏膜的表达[20]，促进钙的吸收对结肠癌有防御作用[21]。有学者通过用TRPV6特异性siRNA转染后的结肠癌细胞株Caco-2试验，发现该结肠癌细胞的增殖减少40%，且细胞凋亡增加了原本的两倍以上[22,23]。亦有试验表明，通过激动剂25(OH)2D3和抑制剂剂(CuCl2)的作用可使大肠癌细胞凋亡增加，而细胞内钙离子明显增加，与既往增加钙离子的吸收可预防结肠癌报道说法不同。对于在结肠癌细胞中过表达的TRPV6来说，可通过构建TRPV6特异性shRNA暂无进一步研究。进一步通过实验证明新型钙离子通道与结肠癌细胞的增殖、迁移及凋亡等形态变化，是否与钙离子的增加或减少有直接联系仍有待于进一步研究。

综上所述，有多数研究是通过阻断信号通路，影响大肠癌细胞生长所需物质关键蛋白质的生成，从而抑制癌细胞的增殖。部分研究证实RNA干扰相关信号通路基因的表达而使抑癌基因处于激活状态，从而促进癌细胞的增殖和迁移。也有部分研究表明阻断信号通路对癌细胞的增殖或迁移并无直接影响，而是通过影响该基因上游或下游基因的表达从而影响癌细胞发生发展。RNAi的出现为我们在未知基因功能的检测上提供重要的手段。大肠癌细胞的增殖、迁移或凋亡与相关信号通路变化密切相关，了解相关信号通路对与癌细胞发生及发展的机制，对大肠癌的预防和治疗起到重要作用。

结合近几年国内外学者在RNAi技术研究结果，本文对既往在RNAi技术上存在的部分问题进行梳理：特异性siRNA转染到细胞内，能否保证siRNA的稳定性，研究证实高密度脂蛋白纳米粒子明显改善裸体siRNA的稳定性，使其在细胞内稳定表达[24,25]。

随着科学技术水平的不断发展，RNAi从体外细胞的培养研究模式走向实体试验，甚至将RNAi用于作为大肠癌的有效治疗手段都指日可待，对于临床试验来说，如何选择一个最佳生物安全水平是至关重要的。对于有多基因参与的肿瘤相关疾病，siRNA适合的治疗量及能否用多个基因的siRNA来治疗肿瘤也是有待于进一步研究的问题。

参考文献：

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] Strillacci A, Griffoni C, Lazzarini G, et al. Selective cyclooxygenase-2 silencing mediated by engineered E. coli and RNA interference induces anti-tumour effects in human colon cancer cells[J]. Br J Cancer, 2010,103(7):975-986.

[3] Yang J, Sun M, Zhang A, et al. Adenovirus-mediated siRNA targeting Bcl-xL inhibits proliferation, reduces invasion and enhances radiosensitivity of human colorectal cancer cells[J]. World J Surg Oncol, 2011,9:117.

[4] Zheng J， Zhang L， Zhang J， et al. Single modification at position 14 of siRNA strand abolishes its gene-silencing activity by decreasing both RISC loading and target degradation[J]. The FASEB Journal, 2013,27(10):4017-4026.

[5] Rao DD, Wang Z, Senzer N, et al. RNA interference and personalized cancer therapy[J]. Discov Med, 2013,15(81):101-110.

[6] Chen SH, Zhaori G. Potential clinical applications of siRNA technique: benefits and limitations[J]. Eur J Clin Invest, 2011,41(2):221-232.

[7] Bora RS, Gupta D, Mukkur TK, et al. RNA interference therapeutics for cancer: challenges and opportunities (review)[J]. Mol Med Rep, 2012,6(1):9-15.

[8] Suvà ML, Riggi N, Bernstein BE. Epigenetic reprogramming in cancer[J]. Science, 2013,339(6127):1567-1570.

[9] Yang Y. Wnt signaling in development and disease[J]. Cell Biosci, 2012,2(1):14.

[10] Ding Y, Zhang Y, Xu C, et al. HECT domain-containing E3 ubiquitin ligase NEDD4L negatively regulates Wnt signaling by targeting dishevelled for proteasomal degradation[J]. J Biol Chem, 2013,288(12):8289-8298.

[11] Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ. NEDD4L is downregulated in colorectal cancer and inhibits canonical WNT signaling[J]. PLoS One, 2013,8(11):e81514.

[12] Gulubova M, Manolova I, Ananiev J, et al. Role of TGF-beta1, its receptor TGFbetaRII, and Smad proteins in the progression of colorectal cancer[J]. Int J Colorectal Dis, 2010,25(5):591-599.

[13] Tanaka T, Watanabe T, Kazama Y, et al. Chromosome 18q deletion and Smad4 protein inactivation correlate with liver metastasis: A study matched for T- and N- classification[J]. Br J Cancer, 2006,95(11):1562-1567.

[14] Wu ZL, Song YQ, Shi YF, et al. High nuclear expression of STAT3 is associated with unfavorable prognosis in diffuse large B-cell lymphoma[J]. J Hematol Oncol, 2011,4(1):31.

[15] Zhang M, Zhou Y, Xie C, et al. STAT6 specific shRNA inhibits proliferation and induces apoptosis in colon cancer HT-29 cells[J]. Cancer Lett, 2006,243(1):38-46.

[16] Qian WF, Guan WX, Gao Y, et al. Inhibition of STAT3 by RNA interference suppresses angiogenesis in colorectal carcinoma[J]. Braz J Med Biol Res, 2011,44(12):1222-1230.

[17] Bogaert J, Prenen H. Molecular genetics of colorectal cancer[J]. Ann Gastroenterol, 2014,27(1):9-14.

[18] Normanno N, Tejpar S, Morgillo F, et al. Implications for KRAS status and EGFR-targeted therapies in metastatic CRC[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2009,6(9):519-527.

[19] Peleg S, Sellin JH, Wang Y, et al. Suppression of aberrant transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 6 expression in hyperproliferative colonic crypts by dietary calcium[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010,299(3):593-601.

[20] Ko SH, Lee GS, Vo TT, et al. Dietary calcium and 1,25-dihydroxyvitamin D3regulate transcription of calcium transporter genes in calbindin-D9k knockout mice[J]. J Reprod Dev, 2009,55(2):137-142.

[21] Fukushima A, Aizaki Y, Sakuma K. Short-chain fatty acids induce intestinal transient receptor potential vanilloid type 6 expression in rats and Caco-2 cells[J]. J Nutr, 2009,139(1):20-25.

[22] Santoni G, Farfariello V, Amantini C. TRPV channels in tumor growth and progression[J]. Adv Exp Med Biol, 2011,704:947-967.

[23] Lehen′kyi V, Rapha⊇l M, Prevarskaya N. The role of the TRPV6 channel in cancer[J]. J Physiol, 2012,590(6):1369-1376.

[24] Miele E, Spinelli GP, Miele E, et al. Nanoparticle-based delivery of small interfering RNA: challenges for cancer therapy[J]. Int J Nanomedicine, 2012,7:3637-3657.

[25] Shahzad MM, Mangala LS, Han HD, et al. Targeted delivery of small interfering RNA using reconstituted high-density lipoprotein nanoparticles[J]. Neoplasia, 2011,13(4):309-319.

本刊2016年第56卷第5期“BNP联合心肌酶谱检测对冠心病危险分层和冠脉搭桥术疗效的预测作用”一文的作者及单位更改为：刘志强1，2，刘寅1，杨刘顺2，李英伟2，孙树申2(1 天津医科大学研究生院，天津300070；2 天津市津南区咸水沽医院)；通信作者：刘寅(E-mail： 1637767441@qq.com)。特此声明。

本刊编辑部

(收稿日期：2015-11-28)

中图分类号：R735.34

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0092-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.037

通信作者：刘模荣(E-mail:zylmr@163.com)

基金项目：贵州省国际科技合作计划项目(黔科合G字(2014)7014号)。