miR-7对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的逆转作用及机制

路选，陈飞，王颖，李瑞青，高小康，孙鹤庆(扬州市第一人民医院，江苏扬州225000)



miR-7对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的逆转作用及机制

路选，陈飞，王颖，李瑞青，高小康，孙鹤庆(扬州市第一人民医院，江苏扬州225000)

摘要：目的探讨microR (miR)-7对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的逆转作用及可能的下游分子机制。方法采用ADR诱导体外人乳腺癌MCF-7细胞，建立阿霉素耐药性MCF-7/ADR细胞株；MCF-7或MCF-7/ADR乳腺癌细胞转染miR-7过表达载体(miR-7 mimic) 或干扰miR-7载体(miR-7 inhibitor)48 h后，阿霉素(100 ng/mL)处理24 h，MTT法测算细胞存活率；荧光定量PCR法测定miR-7和ABCC10 mRNA表达；蛋白免疫印迹法检测ABCC10蛋白表达。结果MCF-7/ADR细胞表达低水平的miR-7和高水平的ABCC10。MCF-7/ADR过表达miR-7，ABCC10 mRNA 和蛋白表达受抑制，细胞的阿霉素敏感性增加，细胞活性下降；MCF-7低表达miR-7，ABCC10 mRNA和蛋白表达增加，细胞的阿霉素敏感性降低，而细胞活性增加。结论调控miR-7表达能逆转乳腺癌细胞阿霉素耐药性，其机制可能是miR-7通过调节ABCC10表达实现。

关键词：乳腺癌；阿霉素；细胞活性；微小RNA-7；ABCC10蛋白

乳腺癌是威胁女性健康常见的恶性肿瘤[1]。尽管随着预防筛查及诊疗技术的发展，乳腺癌的病死率明显降低，但仍有部分乳腺癌患者发展为恶性肿瘤，其中主要原因是患者对初期化疗无效，产生耐药性[2]，如阿霉素耐药。研究发现，microRNAs是哺乳动物体内普遍存在的一类非编码小分子RNA，可通过对功能蛋白的表达调控，在乳腺癌的各类生理病理过程中发挥重要作用[3～5]。miR-7是调控乳腺癌发病的重要微小RNA(miRNA)[6,7]，可参与调控乳腺癌的治疗[8]。ABCC10 是新近发现的ABC 家族，介导癌症的多种药物敏感性。2014年1～12月，我们通过调控人乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR细胞系miR-7表达，探讨miR-7对乳腺癌细胞阿霉素敏感性的逆转作用及其可能机制。

1材料与方法

1.1材料人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院细胞库；RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；阿霉素(美国Sigma公司)；兔抗人ABCC10多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG(美国Santa Cruz Technology公司)；β-Actin抗体(美国Abcam公司)；胰蛋白酶、RPIR细胞裂解液(美国Invitrogen公司)；miR-7和ABCC10引物(上海生物工程公司)；SYBR Green 试剂盒(大连宝生物科技公司)；PVDF膜(美国 Millipore 公司)；MTT比色试剂盒(美国 Becton, Dickinson and Company)；miR-7 mimic和miR-7 inhibitor(美国Thermo scientific 公司)。

1.2细胞培养和ADR耐药细胞系的建立MCF-7细胞培养于10% FBS的RPMI1640 完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，以后每间隔3 d换液1次，待细胞增殖密度达90%左右时进行传代培养。0.25%的胰酶消化贴壁细胞，离心后加入新的培养基，37 ℃、5%CO2条件下进行传代培养。取对数生长期的MCF-7细胞，制成5×107细胞悬浮液，取10 mL悬浮液接种至培养瓶，培养24 h后，加入阿霉素至其终浓度为10 ng/mL，孵育48 h，弃去培养基。新鲜培养基再培养48 h。如此反复培养，逐步提高阿霉素的作用浓度，最终获得耐受500 ng/mL阿霉素的细胞系称为MCF-7/ADR，并维持培养在含10 ng/mL阿霉素的完全培养基。

1.3MCF-7及MCF-7/ADR细胞中miR-7表达检测采用荧光定量PCR法。将贴壁生长的MCF-7及MCF-7/ADR细胞用胰蛋白酶消化，加入培养基终止消化，离心弃上清，加裂解液反复吹打使细胞悬浮、裂解；氯仿-异戊醇法提取细胞裂解中的RNAs；分光光度法检测RNA样品的纯度和浓度，260 nm/280 nm吸光度比值1.8～2.0视为RNA纯度合格；根据反转录试剂盒说明，取2 μg的RNA样本，制备20 μL反转录体系，在反转录酶催化下，反转录成cDNA；取1 μL的cDNA样本，制备50 μL定量PCR反应体系，其中包含SYBR Green Ⅰ荧光和miR-7 和ABCC10 mRNA 的引物，经历94 ℃预变性1 min，95 ℃变性25 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35个循环；循环结束之后72 ℃再延伸5 min。升温速率为0.4 ℃/次，恒温时间为30 s/次，制作熔解曲线，用于评价PCR扩增的特异性。miR-7的内参基因为U6，相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法。

1.4MCF-7及MCF-7/ADR细胞中ABCC10 mRNA、蛋白表达检测采用蛋白免疫印迹法。取贴壁培养的MCF-7细胞，PBS清洗后，根据蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白；Bradford法对蛋白进行定量；等量40 μg蛋白样品加入2X蛋白上样缓冲液，100 ℃变性5 min；样品加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳，60 V浓缩胶电压，110 V分离胶电压；电泳结束后进行PVDF转膜；转膜结束，清洗膜，封闭液常温封闭非特异性结合蛋白2 h；一抗4 ℃孵育过夜；二抗室温孵育2 h；根据超敏ECL化学发光试剂盒说明书，结合凝胶成像仪，检测ABCC10蛋白条带，以β-actin为内参，比较不同处理的细胞中ABCC10蛋白表达水平。

1.5miR-7 mimic 和miR-7 inhibitor转染取对数生长期的MCF-7及MCF-7/ADR细胞，以细胞密度为5×105/孔接种于6孔板，待细胞生长至密度为50%～60%时按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂说明书，将100 nmol/L的miR-7 mimic (miR-7 mimic组)或pre-NC(pre-NC组)转染至MCF-7/ADR；miR-7 inhibitor(miR-7 inhibitor组)或NC(NC组)转染至MCF-7，孵育 48 h收集细胞，参照1.3、1.4中方法检测miR-7、ABCC10蛋白表达。

1.6细胞活性检测 采用MTT法。取miR-7 mimic 或miR-7 inhibitor处理后的细胞悬浮液，加入5、10、20、40 ng/mL或0.5、1、2、4 ng/mL的阿霉素。细胞置于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。然后再培养液中加入二甲基亚砜，振荡溶解，置于自动酶标仪570 nm处测各孔吸光密度(OD)。

2结果

2.1MCF-7及MCF-7/ADR细胞中miR-7和ABCC10蛋白表达比较miR-7在乳腺癌细胞MCF-7、耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR中的相对表达量分别为1、0.28±0.04，ABCC10 mRNA在乳腺癌细胞MCF-7、耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ ADR中的相对表达量分别为1、2.90±0.26，与MCF-7相比，P均<0.01。

2.2miR-7过表达的MCF-7/ADR细胞中ABCC10 mRNA表达ABCC10 mRNA在miR-7过表达的MCF-7/ADR细胞中的相对表达量为0.36±0.04，与Pre-NC转染组对比，miR-7 mimic转染MCF-7/ADR细胞，过表达miR-7，抑制了ABCC10 mRNA和蛋白表达。

2.3miR-7抑制表达的MCF-7细胞中ABCC10 mRNA表达ABCC10 mRNA在抑制miR-7表达的MCF-7细胞中的相对表达量为2.70±0.21，与NC转染相比，miR-7 inhibitor转染MCF-7细胞抑制miR-7表达，引起ABCC10 mRNA和蛋白表达上调。

2.4MCF-7/ADR细胞过表达miR-7后细胞活性转染miR-7 mimic增加了MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性，细胞活性显著下降。Pre-NC组5、10、20、40 ng/mL阿霉素干预MCF-7/ADR细胞后细胞活性分别为95.3±2.1、84.7±3.5、75.3±4.5、63.3±5.0，miR-7 mimic组5、10、20、40 ng/mL阿霉素干预MCF-7/ADR细胞后细胞活性分别为88.7±4.5、66.3±4.2、49.0±4.6、37.0±0.0，两组10、20、40 ng/mL阿霉素干预后细胞活性比较，P均<0.01。

2.5抑制miR-7表达对细胞活性的影响转染miR-7 inhibitor减弱了MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性，细胞活性增加。NC组0.5、1、2、4 ng/mL阿霉素干预MCF-7/ADR细胞后细胞活性分别为89.0±4.0、63.3±2.1、48.7±5.5、27.7±2.5，miR-7 inhibitor组0.5、1、2、4 ng/mL阿霉素干预MCF-7/ADR细胞后细胞活性分别为92.3±3.1、80.3±3.1、69.7±4.2、55.7±5.0，两组1、2、4 ng/mL阿霉素干预后细胞活性比较，P均<0.01。

3讨论

目前化疗或辅助化疗仍是治疗乳腺癌的重要手段。部分患者由于对化疗的抵抗性导致癌症复发死亡。阿霉素是用于乳腺癌的主要化疗药物，其机制是通过抑制肿瘤细胞生长和促进细胞凋亡来控制肿瘤。如何控制乳腺癌细胞的阿霉素耐药性是目前亟待解决的问题。

miRNA是真核细胞中普遍存在的一类小分子RNA，长度约22 bp，主要参与功能基因转录后调控，通过与目标基因的mRNA结合，介导mRNA的降解或抑制mRNA翻译。研究发现，超过50%的miRNA基因位于癌相关的基因组区域，miRNA在肿瘤发生机制中扮演重要角色。肿瘤组织中miRNA表达处于低水平亦或高水平，调控致癌基因或抑癌基因的表达。miR-7 被认为是多种肿瘤的抑制分子，包括肾上腺皮质癌[9]、宫颈癌[10]和乳腺癌[11]等。近期，miR-7被认为可调控肺癌[12]等肿瘤的化疗敏感性，但其对乳腺癌的阿霉素敏感性的调控鲜有报道。ABCC10水平影响肿瘤的生长、迁移,同时亦是介导多种肿瘤化疗敏感性的功能蛋白[13]。因此，我们推测miR-7可能调控ABCC10表达，并参与乳腺癌细胞的阿霉素敏感性调节。

miRNA mimic 是一种化学合成的RNA寡核苷酸，可模拟内源miRNA，提高细胞内miRNA水平，增强miRNA的功能。另外，miRNA inhibitor 作为特异性靶miRNA的抑制剂，导致内源性miRNAs表达降低。因此，miRNA mimic 和miRNA inhibitor 常用来操纵miRNA表达，进行miRNA功能研究。在我们的实验中，MCF-7/ADR 细胞中miR-7表达下降，所以我们在MCF-7/ADR 中转染miRNA-7 mimic，在MCF-7细胞中转染miR-7 inhibitor, 结果显示，miR-7过表达抑制了MCF-7/ADR细胞的ABCC10 mRNA和ABCC10蛋白表达，表明miR-7可负向调控ABCC10表达。另外，miR-7过表达增加了MCF-7/ADR细胞的阿霉素敏感性，引起细胞活性降低；干扰miR-7增强了MCF-7细胞的阿霉素活性，导致细胞活性下降。由此可见，上调miR-7表达可增加MCF-7的阿霉素化疗敏感性，其可能机制是通过调控ABCC10表达实现。

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Reverse offect of miR-7 on adriamycin resistance of breast cancer cells

LUXuan,CHENFei,WANGYing,LIRuiqing,GAOXiaokang,SUNHeqing

(TheFirstPeople'sHospialofYangzhou,Yangzhou225000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the reverse effect of microR (miR)-7 on adriamycin resistance of breast cancer cells and its downstream molecule mechanism. MethodsHuman breast cancer MCF-7 cell line was exposed to gradually increasing density of adriamycin (ADR) that was used to establish ADR-resistant MCF-7/ADR cell line. MCF-7 or MCF-7/ADR cells were transfected with miR-7 mimic or miR-7 inhibitor for 48 h. Then cells were exposed to ADR (100 ng/mL) for 24 h. MTT assay was used to evaluate cell survival, fluorescent quantitative PCR was used to determine miR-7 and ABCC10 mRNA expression and immunoblotting was used to determine ABCC10 protein expression. ResultsMCF-7/ADR cell expressed lower level of miR-7 and high level of ABCC10. MiR-7 overexpression in MCF-7/ADR cell inhibited ABCC10 mRNA and protein expression and enhanced ADR resistance thereby leading to the reduction of cell viability. In the contrary, silencing miR-7 in MCF-7 promoted ABCC10 mRNA and protein expression and increased cell viability.ConclusionRegulating MiR-7 expression may reverse the ADR resistance of breast cancer cells and its mechanism may be that miR-7 reverses ADR resistance by regulating ABCC10 expression.

Key words:breast carcinoma; adriamycin; cell viability; microRNA-7; ABCC10 protein

(收稿日期：2015-12-24)

中图分类号：R737.9

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.007

第一作者简介：路选(1980-)，男，主治医师，主要研究方向为乳腺肿瘤的理论与临床研究。E-mail：xuanlulx@163.com