胎盘氧化应激及营养调控研究进展

■徐建雄 罗 振

（上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240)

2013年数据显示，我国母猪的繁殖性能，如分娩率、年产仔数和产活仔数等均明显低于欧美水平[1]。在养殖生产中，动物的繁殖性能直接决定了养殖业的经济效益，而胚胎期的死亡是动物产仔数低的主要因素，严重影响动物繁殖性能和养殖业的持续发展。因此，妊娠期的动物健康是胎儿存活和发育的最关键时期。而哺乳动物的胎盘作为连接母体和胎儿的桥梁，它不仅转运营养物质、排泄废物、还能分泌固醇类激素，为胎儿提供免疫物质等。胎盘的发育和功能的完整是保障胎儿正常生长的前提条件[2]。事实上，在许多物种中，胎儿的出生重与胎盘重量呈现正相关，胎盘可以作为衡量胎儿在母体内生长能力的指标之一[3]。胎盘组织常被作为评估母体与胎儿健康状况的生物标本[4]。

胎盘，通常是指尿囊-绒毛膜和子宫黏膜发生联系所形成的一种暂时性构造。由两部分组成，尿囊-绒毛膜的绒毛部分为胎儿胎盘，子宫黏膜部分为母体胎盘[5]。正常的胎盘形成和发育有利于胎儿的生长，胎盘的功能不足是影响疾病发生的主要原因之一，比如自然流产、IUGR等。影响胎盘发育和功能的因素很多，包括营养、应激和疾病等。而近年来，关于氧化应激对胎盘的结构和功能影响的报道越来越受到关注。

1 氧化应激与胎盘

活性氧（ROS）是生物体内小的、高活性的自由基。主要来源于线粒体呼吸链、NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶等。在正常生理条件下，它能作为细胞内的信号分子发挥作用。ROS主要包括：超氧阴离子（·O2-）、过氧化物、羟自由基（·OH）等。体内最常见的是超氧阴离子（·O2-），线粒体为其主要来源。据报道，线粒体呼吸链转移电子并不是完全高效的，有2%的氧消耗转化成超氧阴离子（·O2-）而不是生成水[6]。而机体的抗氧化物质，根据其定位可分为三类：①第一类是血浆抗氧化物质，如维生素C、胆红素等；②第二类是细胞膜抗氧化物质，如维生素E；③第三类是细胞内抗氧化物质，如SOD、GSH-Px、CAT等。研究报道，妊娠前三个月胎盘处在低氧环境中，而从妊娠10～12周时，母胎血液循环建立，高氧环境引发胎盘ROS产生，打破了胎盘的抗氧化-促氧化平衡，发生氧化应激[7-8]。Jauniaux等（2000）[9]证明，在怀孕第8～9周时，人胎盘合胞体滋养层中热激蛋白HSP70和硝基酪氨酸（氧化应激指标）显著增加，电镜发现线粒体嵴重新分布。表明胎盘血液循环建立初期，发生了显著的氧化应激。因此，可以推测胎盘氧化应激，一方面可能促进胎盘细胞分化，同时也可能是导致胎盘疾病的病理因子。Hung等（2001）[10]在子痫前期孕妇胎盘上皮和血管平滑肌及合胞体滋养层中发现了热激蛋白HSP72，ROS水平显著升高[11]，证实了病理胎盘组织存在严重的氧化应激。ROS诱导的胎盘及大分子脂质、蛋白质损伤超过机体的自我调控能力时，将导致妊娠并发症，如流产、早产、子宫内生长停滞及子痫症等的发生，影响胎儿的生长发育和健康[12]。

胎盘氧化应激诱导胎盘结构和功能的改变与细胞分化、增生、凋亡等基因和蛋白的表达改变相关[13]。因此，本文主要围绕胎盘氧化应激与血管发生、凋亡、自噬、转运能力四个方面及从营养添加抗氧化剂的角度对畜牧生产的影响来介绍氧化应激对胎盘结构和功能的关系。

2 胎盘氧化应激与结构

2.1 胎盘氧化应激与血管发生（血流量）

胎盘的血管形成对胎儿的生长发育至关重要。它能够提供营养物质和氧气及血流供给，是保证胎盘行使正常功能的基础。研究表明，胎盘、胎儿重量和胎盘血流量之间存在显著正相关性[14]。血管形成主要包括血管发生vasculogenesis和angiogenesis。Vasculogenesis过程主要是从前体细胞中重新形成血管壁，而angiogenesis则是从已经存在的血管中产生新的血管壁[15]。一些基因和蛋白被认为参与调节血管发生。事实上，体内的这些因子可以分为两类，促血管生成因子如VEGF和PIGF；抗血管生成因子如endoglin（sEng）和sFlt-1等。VEGF家族包括7种蛋白质，从VEGF-A到VEGF-F和胎盘生长因子（PIGF）7种[16]。VEGF的减少可使血管内膜完整性受损，内皮细胞增殖能力减弱，胎盘血管生成和血流减少，进一步加重内膜损害，引起小动脉痉挛[17]。研究表明，抗血管因子sEng来自于合胞体滋养层，在先兆子痫血液中增加，而促血管因子PIGF却显著降低。原因是抗血管生成因子sFlt-1能失活VEGF，导致上皮功能失调[18]。胎盘发育初期氧气浓度较低，这有利于血管发生（vasculogenesis和angiogenesis），研究表明，当母源贫血时，胎盘氧气的浓度比正常更低，而血管形成线(hemangiogenic cords)量增加。另外，超声结果显示，胎盘外周绒毛氧气浓度要高于中心绒毛，而比较胎盘中心和外周区域的绒毛时发现，外周绒毛要么血管很少，要么是降解的毛细血管。表明，高氧作用效果相反。提示，氧的浓度能作为主要调节因子调控血管生成因子VEGF和PIGF的表达[17]。研究发现，低氧能够刺激产生ROS，导致HIF-1α积累，从而增加VEGF mRNA的表达。产生的VEGF能够继续诱导产生ROS，进而增加HIF-1和VEGF蛋白表达，构成了ROS对血管重塑和血管发生的一种前馈机制[19]。

胎盘氧化应激，导致浸润能力异常和子宫螺旋小动脉重铸障碍，胎盘血管功能异常和内皮细胞损伤，是近年来对胎盘氧化应激学说的里程碑性的拓展[20]。NO作为一种血管舒张和抗血凝因子，能维持血管张力来增加子宫胎盘血流量。同时，它还能够通过降低黏附分子（如ICAM-1、E-selectin）的表达降低炎症反应[21]。血管功能失调的原因推测可能是：一方面，机体产生大量的超氧根离子（·O2-）能够减少NO的生物活性。另一方面，NO和·O2-反应生成过氧亚硝酸盐，它是一种强有力的促氧化剂，能够直接抑制线粒体呼吸链，氧化蛋白质巯基，硝化芳香族氨基酸和断裂DNA链，对血管上皮直接作用[8]。有研究报道，在子痫和妊娠糖尿病的子宫胎盘血管和胎盘绒毛间质中有硝基酪氨酸的表达，表明过氧亚硝酸的形成可能参与了这种病理的改变[22]。

2.2 胎盘内质网应激与细胞凋亡

细胞凋亡（I型程序化死亡）可在一系列生理和病理条件下出现，是维持机体生理机能和稳定的一种调节机制。细胞凋亡具有独特的形态学和生化学特征。早期凋亡时，在光镜下可见细胞皱缩、染色质浓缩和凋亡小体，细胞体积变小，细胞质和细胞器浓缩。HE染色凋亡细胞呈现单个细胞或者细胞聚集的圆形或者椭圆形，浓紫色的染色体片段[23]。凋亡细胞经历一系列过程，如细胞膜出泡，细胞质浓缩，被凋亡小体包裹，随后被相邻近的巨噬细胞识别和吞噬。同时，细胞凋亡是一个复杂的耗能过程，需要多种基因和蛋白质的参与。一般来说，触发凋亡信号转导途径可以分为死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径[24]。我们先前的研究表明，断奶应激能诱导机体氧化应激，通过激活肠细胞的死亡受体途径和线粒体途径而增加凋亡[25]。近年来，胎盘内质网应激诱导的凋亡在胎盘疾病方面的调控越来越受到关注。

内质网主要功能包括蛋白质翻译后修饰、折叠和组装新合成的分泌蛋白及调节钙离子平衡。内质网应激是一种重要的细胞自我防御机制，主要通过激活未折叠蛋白反应（UPR）来维持细胞存活和正常的功能。UPR主要包括3种调控途径：①通过减少蛋白质翻译，从而减少进入内质网腔的蛋白质，这一步主要涉及激活内质网应激激酶PERK，磷酸化下游真核翻译起始因子eIF2α，阻止Met-tRNA与核糖体结合，调节翻译起始；②第二条通路是通过增加内质网分子伴侣蛋白GPR78和GPR94，及折叠酶如蛋白二硫化异构酶、肽基脯氨酸异构酶等的表达，激活下游转录因子ATF6，调节膜内蛋白质水解；③第三条是通过Ire1通路，Ire1包含核酸内切酶，能剪切前体XBP-1mRNA，形成41 kDa的XBP-1蛋白，来降解错误折叠的蛋白质[26]。Yung等（2008）[26]首次报道，IUGR胎盘中磷酸化eIF2α和内质网应激蛋白表达增加，表明胎盘蛋白质合成抑制和内质网应激可能是导致IUGR的病因之一。Fu等（2015）[27]在早期和晚期先兆子痫病人胎盘中，发现内质网应激相关指标PERK、GPR78、ATF6、eIF2a、CHOP及凋亡酶caspase12的mRNA和蛋白表达显著增加。同时，电镜结果显示，先兆子痫和IUGR胎盘内质网形态学发生了显著改变[28]，合胞体滋养层细胞凋亡明显增加[29]。提示内质网应激诱导的胎盘凋亡是先兆子痫和IUGR疾病发生的机理之一。

2.3 胎盘氧化应激与自噬

自噬（II型程序化死亡），生理学上是细胞器发生，蛋白质合成和清除之间的平衡，属于机体的一种自我保护机制。自噬主要的生理功能是能够将胞质中的大分子物质和一些损坏的细胞器通过溶酶体途径降解，实现能量的再循环，以维持细胞自身的稳定[30]。自噬机制分为三种：大自噬（macroautophagy），小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy)。目前研究最充分的是大自噬。大自噬主要过程包括形成双层膜结构的自噬小泡包裹形成自体吞噬体，自体吞噬体与溶酶体（lysosomes）融合，在酸性水解酶的调节下，细胞成分被降解为小分子物质，再释放到细胞质重新利用[31]。已经发现35种自噬相关基因（Autophagy-related gene，Atg）和50多种溶酶体水解酶在自噬形成的不同阶段中发挥作用[32]。Scherz-Shouval等（2007）[33]首次报道证明了，营养缺乏诱导产生的ROS，能作为信号分子通过增加Atg4的表达而增加自噬，提供了氧化还原调节自噬的分子机制。同时，在心肌缺氧再灌注的条件下，自体吞噬体和自溶酶体显著增加，而添加抗氧化剂能显著改善自噬通量，表明氧化应激在自噬形成过程中发挥重要作用[34]。

而近几年关于胎盘自噬的研究才开始报道。Signorelli等（2011）[35]在正常人的末期胎盘中检测到自噬蛋白的表达，并发现其受到胎儿脐动脉葡萄糖浓度的影响。而Hung等(2012)[36]在IUGR胎盘的滋养层细胞和间质细胞中发现自噬相关蛋白LC3B-II、beclin-1和 damage-regulated autophagy modulator（DRAM）的表达增加，同时细胞质P53抑制自噬而细胞核P53诱导和调节自噬。高丽等（2014）[37]检测人早发型子痫前期胎盘滋养细胞和血管内皮细胞时发现，自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达增加，证实了胎盘中滋养细胞和血管内皮细胞发生过度自噬可能是导致胎盘功能紊乱的因素之一。

3 胎盘氧化应激与功能

3.1 胎盘氧化应激与营养物质转运

胎盘作为联系母体和胎儿的桥梁，为胎儿提供营养物质，保证其生长发育。而营养物质的转运离不开胎盘上特定的转运载体。目前，根据转运载体的底物特异性和钠离子依赖性，现已识别和鉴定的哺乳动物的转运系统达到15种。由于胎盘结构中的合胞体滋养层位于母体循环和胎儿毛细血管上皮之间。因此，营养物质通过滋养层到达脐带循环需要三个过程：①从母源血浆吸收营养物质，然后穿过胎盘微绒毛膜层；②转运穿过滋养层细胞质；③穿过滋养层基底膜到达脐带循环；这种转运依赖于滋养层微绒毛膜和基底膜上的转运载体。

3.1.1 葡萄糖转运

胎盘和胎儿的主要能量来源是葡萄糖，据报道有50%～60%的葡萄糖被胎盘利用，剩下的才被胎儿利用。由于妊娠早期胚胎不能自身合成，主要依靠胎盘葡萄糖的转运。葡萄糖的转运依赖于葡萄糖转运蛋白 GLUT，GLUT 家族主要包括 GLUT-1、GLUT-3、GLUT-4、GLUT-8、GLUT-12等亚型[38]。这些转运蛋白显示出了不同的动力学特征、定位和组织特异性。GLUT-1主要参与跨胎盘葡萄糖转运，在各类组织细胞中普遍存在。而GLUT-3和GLUT-4主要在上皮细胞和间质细胞中表达，因此不能跨胎盘转运[39]。

3.1.2 氨基酸转运

母体供给胎儿能量的20%～40%是氨基酸形式，胎儿生长发育所需要的各种氨基酸主要由胎盘氨基酸转运载体介导的主动转运过程进行。体内主要的氨基酸转运载体根据其钠离子依赖性可分为钠离子依赖系统A、ASC、β-、N等和钠离子非依赖系统如L，y+，y+L等[40]。系统A和ASC主要转运兼性氨基酸，系统β主要转运牛磺酸，系统L主要转运中性氨基酸和支链氨基酸。系统y+和y+L主要转运阳离子氨基酸；各个系统之间既相互独立也部分重叠[41]。

3.1.3 脂质转运

脂肪酸是机体的膜磷脂组成成分、能量来源、生物活性物质和信号分子的前体，对早期胎儿发育和生长至关重要。大量研究已表明，妊娠前期和中期机体处于脂肪储存期，而妊娠末期脂质动员增加，血浆中甘油三酯、磷脂和甘油等显著增加。目前已发现机体产生的短链脂肪酸需要单羧酸转运载体（MCTs）介导。MCT1-4是至今发现最具有特征的亚型，广泛分布于多个组织，在机体营养平衡和氧化还原平衡状态中发挥重要作用[42]。长链脂肪酸转运蛋白主要包括：FATP1-6、脂肪酸转位酶和膜脂肪酸结合蛋白等[43]。胆固醇的转运方式有三种：膜孔扩散、ATP结合盒转运载体A1（ABCA1）调节的单向转运、B类I型清道夫受体调节的双向转运（SR-BI）[44]。调节脂肪酸转运蛋白能够改变机体的胰岛素敏感性和能量平衡，影响胎儿的生长发育。

3.2 氧化应激与转运载体

Jansson（2001）发现，IUGR胎盘转运系统发生了改变，微绒毛膜转运系统A显著降低，且胎盘中赖氨酸、亮氨酸、牛磺酸等氨基酸转运系统也降低，ABCA1转运蛋白功能损失，但合胞体滋养层中葡萄糖转运载体GLUT-1未改变[45-46]。过表达硫氧还蛋白能够减少鼠胎盘氧化应激和促进胎儿的生长，增加胎盘葡萄糖GLUT-1的表达[47]。母鼠妊娠期摄入高脂日粮，可导致母体、胎儿和胎盘氧化损伤指标MDA和蛋白质羰基增加，胎盘氨基酸转运载体Slc7a1 mRNA表达增加。而高脂日粮添加NAC后，母鼠自由基清除能力增加，胎盘MDA和蛋白质羰基显著降低，胎儿抗氧化基因SOD等显著增加，同时降低了Slc7a1mRNA表达[42]。以上研究表明，特异性胎盘养分转运载体的变化可能是胎盘氧化应激影响胎盘功能和胎儿生长发育的机制。有趣的是，收集BMI不同的肥胖个体的胎盘组织，通过测定其氧化应激指标羰基和硝基时发现，伴随着BMI指数的增加，蛋白质硝基的含量增加而羰基含量降低[48]。提示我们，氧化应激导致的蛋白羰基向硝基转换可改变蛋白质功能，从而影响胎盘功能。而这种改变涉及到胎盘酶、受体、转运载体、信号传导分子、结构蛋白和激素等一系列因子[49]。而关于氧化应激如何影响胎盘的转运能力，调控胎儿生长发育的具体机制，还有待进一步研究。

4 母源、胎盘氧化应激与畜牧生产

集约化养猪生产上，母猪的繁殖能力和健康状况与养殖业的生产效益直接相关。导致母猪繁殖力低的因素很多，包括饲养管理水平，营养供给不合理及环境应激等。近年来，母猪营养影响胎儿和胎盘的生长发育已成为养殖业的热点之一[1]。

妊娠母猪由于其内在特殊的生理代谢需求，及外界各种应激源的作用，如高温、疾病、营养水平不平衡，养殖环境差和繁殖应激等，本身就是一种氧化应激[7]。Berchieri-Ronchi等（2011）研究表明，妊娠后期母猪会处于严重的分解代谢状态，DNA损伤贯穿于整个妊娠时期，同时妊娠第110 d的母猪血浆α-生育酚和视黄醇浓度比妊娠第30 d母猪分别降低56%和57%，进而加剧氧化应激[50]。研究发现，热应激环境和社会阶层(Social ranks)也显著增加了蛋白质、DNA和脂质的氧化损伤，导致母猪繁殖性能减少[50-51]。本课题组研究发现（待发表），妊娠后期尤其是分娩时母猪血清T-AOC、GSH-Px显著降低，血清中皮质醇、MDA、8-ISO-PGF2α、蛋白质羰基化含量和低氧诱导因子显著增加，妊娠后期和分娩母猪发生了严重的氧化应激和氧化损伤。

猪的胎盘绒毛膜滋养层与子宫内膜均保持完整，两层膜平行紧靠，虽有褶皱起伏，仍各自独立，属于上皮绒毛膜胎盘[52]。而目前关于猪胎盘氧化应激及营养报道的文献还并不多。Chen等（2015）[53]对IUGR猪胎盘进行差异蛋白组学分析，发现5个能量相关蛋白表达降低，8个转运相关蛋白表达降低和13个应激相关蛋白如HSP90和GPR78等表达增加，添加生物活性分子鞘氨醇后，能正向调控子宫和胎盘血管发育。林刚（2014）[54]发现IUGR导致母猪胎盘磷酸戊糖途径受损，GSH降低，干扰胎盘氧化还原平衡，从而导致羊水和脐静脉血营养代谢物如葡萄糖、果糖、尿素、氨、氨基酸等差异明显。并且体外试验表明，添加精氨酸和谷氨酰胺均能促进猪滋养层细胞增殖，但是，只有谷氨酰胺能够直接促进胎盘磷酸戊糖途径，改善其氧化还原状态。同时，作者用不同浓度的亮氨酸处理猪的胎盘滋养层细胞，发现随着浓度增加，各试验组G0～G1期细胞数目逐渐增多，S期细胞数目逐渐减少，并有时间和剂量依赖性。表明，低浓度的亮氨酸可以促进细胞生长，而高浓度的亮氨酸会阻碍正常滋养层细胞周期，从而抑制其增殖活力[55]。

日粮成分是影响母畜、胚胎和胎儿发育的重要因素。近年来，通过添加抗氧化剂（如精氨酸，多酚及一些微量成分维生素A、维生素C、维生素E、硒、Ca和铁等）增强胎盘和胎儿的存活及生长提供了一种有效的解决方案。而这种作用的机制据推测可能对控制胎盘自由基的产生方面起作用。比如，金属元素如Mg、Cu、Zn、Mn、Se等作为抗氧化酶的辅助因子而参与了氧化防御，如金属硫蛋白中的锌、血浆铜蓝蛋白中的铜、SOD中的铜和硒及GSH-Px中硒等。医学研究报道，比较不同的抗氧化剂褪黑激素、S-腺苷甲硫氨酸和维生素E在正常人的妊娠末期胎盘上的转移效率，发现褪黑激素转移最快，S-腺苷甲硫氨酸转移缓慢，维生素E转移效率最慢[56]。妊娠晚期母源添加500 mg维生素C和400 IU维生素E，显著增加了母源血浆维生素E含量，母源血浆维生素C和E的含量与羊膜液维生素C及绒毛羊膜维生素E的含量直接相关[57]。以上研究提示我们，母源抗氧化剂处理能直接作用于子宫胎盘，提高其抗氧化能力，其作用效果跟抗氧化剂的选择相关。Li等（2010）[58]报道，从妊娠开始到25 d添加0.8%精氨酸增加了猪胎盘血管供应，但是降低了子宫重量、总胎儿重量、尿囊和羊膜液体积，不利于胎儿生长。表明，在妊娠母猪初期添加精氨酸不利于胎儿的增长。而Gao等（2012）[59]研究表明，从妊娠22 d到114 d，添加1%精氨酸能增加仔猪窝产仔数、活仔数、窝重和胎盘重量，改善胎盘的增长和调节激素分泌。Zhang等（2016）[60]在羊上研究发现，从妊娠35 d到110 d，日粮添加N-氨甲酰谷氨酸（2.5 g/d）或者过瘤胃保护的精氨酸（10 g/d）能显著改善营养限制导致的母羊宫内发育迟缓，增加了血浆精氨酸家族氨基酸及尿囊和羊膜液多胺含量。进一步研究发现，N-氨甲酰谷氨酸或者过瘤胃保护的精氨酸能显著减少营养限制湖羊血浆皮质醇浓度，增加母源血浆、胎盘组织及胎儿的T-AOC和SOD含量而显著减少MDA。表明，母源添加N-氨甲酰谷氨酸或精氨酸能够改善母源-胎盘-胎儿的抗氧化能力，促进胎儿和胎盘的发育[61]。

综上，动物日粮添加抗氧化剂能直接调节胎盘及胎儿的氧化应激状态，但是其作用效率与宿主健康状况、发育成熟情况、抗氧化剂的选择、添加的时间和剂量等一系列因素相关。由于此方面的研究时间短，理论与技术体系尚需进一步完善。因此，继续开展母源抗氧化剂对胎盘氧化还原状态、结构和功能的关系，对于深入认识抗氧化剂的作用机制、保证动物健康和提高养殖业经济效益具有重要意义。