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青蒿琥酯抑制肝星状细胞m icroRNA-154/β-catenin治疗肝纤维化的机制研究

2016-04-06魏丹芸武汉大学人民医院药学部湖北武汉430060

中国医药导报 2016年1期
关键词:琥酯星状青蒿

张 英  张 洪  彭 锐  魏丹芸武汉大学人民医院药学部,湖北武汉 430060



青蒿琥酯抑制肝星状细胞m icroRNA-154/β-catenin治疗肝纤维化的机制研究

张英张洪彭锐魏丹芸
武汉大学人民医院药学部,湖北武汉430060

[摘要]目的探讨青蒿琥酯抑制肝星状细胞microRNA-154/β-catenin治疗肝纤维化的机制。方法培养大鼠肝星状细胞,用不同浓度(0、5、10、20、30、40μg/mL)青蒿琥酯作用于大鼠肝星状细胞,采用免疫印迹法(Western blot)检测青蒿琥酯作用后细胞内β-catenin蛋白的表达;实时定量RT-PCR检测青蒿琥酯作用后细胞内的miR-154和β-cateninmRNA的相对表达。结果0~40μg/mL青蒿琥酯作用细胞24 h后,免疫印迹法结果显示,βcatenin蛋白量逐渐降低,并呈剂量相关性(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示青蒿琥酯作用后,β-catenin mRNA表达量及miR-154表达量逐渐降低,并呈剂量相关性(P<0.05)。结论青蒿琥酯可能是通过抑制microRNA-154表达作用于Wnt/β-catenin信号通路及来抑制肝纤维化的发生,microRNA-154与Wnt/β-catenin信号通路可能存在一定的相关性。

[关键词]青蒿琥酯曰肝星状细胞曰miR-154曰W nt/β-catenin信号通路曰肝纤维化

肝纤维化是所有慢性肝病发展成肝硬化的共同病理基础与必经途径,是“慢性肝炎-肝纤维化-肝癌”的中心环节,并且具有可逆性[1-2]。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是导致肝纤维化发生的主要发病机制,肝损伤后导致HSC大量活化增殖,从而合成分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),ECM的大量沉积导致肝纤维化的发生[3]。因此促进活化的HSC凋亡可能成为治疗肝纤维化的有效方法。

Wnt/β-catenin信号通路是促肝纤维化细胞凋亡的主要转导通路之一,通路活化后,β-catenin移位至细胞核,与核内T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)结合诱导靶基因转录,促进肝纤维化的发生[4-5]。micoRNA(miRNA)是一类细胞内源性小片段RNA分子,由20~25个核苷酸组成[6]。可以在转录后水平通过调控靶基因的表达而影响细胞的增殖、分化、凋亡及个体的生长发育等生命过程[7-8]。近年来研究发现,miRNA参与了多种疾病的病理过程,是重要的疾病候选诊断标志物及潜在治疗靶点[9]。本课题组发现miR-154在大鼠HSC中表达具有较大程度的上调,抑制miR-154的表达可有效地促进细胞凋亡。

青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素的衍生物,前期研究发现青蒿琥酯可以促进肝星状细胞的凋亡[10],本实验深入探讨了青蒿琥酯作用后HSC中Wnt/βcatenin信号通路中的蛋白表达含量及microRNA-154的表达量变化,研究两者在促进HSC凋亡过程中的相关性。为探讨青蒿琥酯抗肝纤维化的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株大鼠HSC(HSC-T6)购于上海艾研生物有限公司,由美国ATCC细胞库引进,为SV40转染的大鼠肝星状细胞,其表现型为活化的HSC细胞。

1.1.2试药注射用青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司);RPMI-1640培养基(上海吉诺公司);胎牛血清(美国Gibico公司);胰蛋白-EDTA消化液(美国Gibico公司);DMSO(美国Sigma公司);96、6孔板(美国Corning公司);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉谷歌生物有限公司);β-catenin一抗(美国Cell Signaling Technology公司);二抗羊抗兔IgG(美国LI-COR Biosciences公司);RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒及RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司);引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成。

1.1.3仪器超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司);CB150 CO2细胞培养箱(德国Binder公司);HeraeusFresco21低温微量离心机(德国Thermo公司);Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司);NanoDrop 2000c紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司);普通RT-PCR仪(东胜创新生物科技有限公司);7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司);荧光定量PCR管(美国ABI公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养取大鼠HSC(HSC-T6)用RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素,100 U/mL链霉素)培养,于37℃、5%CO2饱和度的细胞培养箱内进行培养,待细胞生长密度大约为90%时,倒掉培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)平衡盐溶液轻轻洗涤细胞

2次,弃去PBS,用0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞,待细胞收缩变圆并开始滑落,立即加入培养基终止消化。轻轻吹打混悬细胞,1000 r/min离心5min,弃上清,用培养基将细胞吹散混悬,进行传代或种板。以3×105个细胞/孔将细胞接种于6孔板,待细胞生长密度至60%~70%时,分别换成用含5、10、20、30、40μg/mL青蒿琥酯的培养基进行培养,并设一孔加等量不含药培养基作为对照组,培养24 h后,提取蛋白质和RNA。

1.2.2细胞总RNA的提取青蒿琥酯作用24 h后收集细胞,按照Trizol RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA。加入1mLTrizol反复吹打使细胞充分裂解,静置15min,加入0.2mL氯仿(Trizol∶氯仿=5∶1),剧烈振荡颠倒30 s,室温静置15min。4℃,12 000 r/min离心15min。移上清液至无酶离心管中,加入等体积异丙醇,静置10min;4℃,12 000 r/min离心15 min,弃上清液,加1 mL预冷的75%乙醇,洗涤RNA。4℃下7500 r/min离心10min,重复1次。晾干至半透明,加入适量焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA,紫外分光光度计测定浓度及纯度,于-80℃保存备用。

1.2.3免疫印迹法(Wes t ern b l ot)测定青蒿琥酯作用后细胞内β-catenin蛋白表达变化青蒿琥酯作用24 h后收集各孔细胞,PBS轻轻洗涤2次,加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白,BCA法测定提取的蛋白浓度。加上样缓冲液,100℃加热煮沸7min。每组取20μg总蛋白上样,利用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组细胞蛋白质,电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用5%BSA封闭液封闭1h,用封闭液稀释相应的一抗,一抗β-catenin兔抗鼠(1∶500)和GAPDH兔抗鼠4℃孵育过夜。TBST洗涤3次,加入羊抗兔二抗,室温摇床上慢速孵育1 h,TBST洗膜3次,利用Odyssey成像系统对PVDF膜进行扫描分析,检测各组细胞的β-catenin与GAPDH蛋白条带的灰度值,计算两者比值作为其相对蛋白表达量。

1.2.4Rea l-t ime PCR测定青蒿琥酯作用后细胞内β-cat enin mRNA及miR-154表达变化取合格的RNA样品,采用逆转录试剂盒和荧光定量SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mixture试剂盒检测β-catenin mRNA、miR-154在各组细胞中的表达情况。β-catenin mRNA以GAPDH为内参,miR-154以U6为反应内参,β-catenin、GAPDH、U6和miR-154的逆转录引物及RT-PCR反应引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成,引物序列见表1。RT-PCR反应条件为:95°C,30 s,1个循环;95°C,5 s,60°C,40 s,共40个循环;95°C,30 s,60°C,1min,95°C,15 s。反应在96孔板中进行,每个反应设3个复孔,共包含20μL的反应体系。反应结束后得到各组的目的基因和内参的Ct值,以内参进行标准化处理,使用ΔΔCT法分析RT-PCR所得数据,根据公式2-ΔΔCT,(ΔCT=CT目的基因-CT内参,ΔΔCT=ΔCTArt组-ΔCT对照组),计算分别得到目的基因β-catenin和miR-154的相对表达量,并进行统计学分析并做图。

表1 RT-PCR中各引物序列

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,相对实时定量PCR测定结果和蛋白表达测定结果处理采用配对t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1青蒿琥酯对大鼠肝星状细胞内β-catenin蛋白表达水平的影响

与空白对照组比较,随着青蒿琥酯药物浓度的不断升高,肝星状细胞内β-catenin蛋白的表达量逐渐降低,并呈剂量依赖性,β-catenin蛋白的表达量与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05),不同浓度组之间β-catenin蛋白的表达量差异有统计学意义(P<0.05),表明青蒿琥酯作用于肝星状细胞可能与Wnt/β-catenin信号通路有关,结果见图1。

图1 青蒿琥酯对大鼠肝星状细胞β-c a t e n i n蛋白的影响

2.2青蒿琥酯对肝星状细胞内β-catenin mRNA及m iR-154表达水平的影响

与空白对照组比较,随着青蒿琥酯药物浓度的不断增加,肝星状细胞内β-cateninmRNA的表达量及miR-154的表达量逐渐降低,并呈剂量依赖性,βcateninmRNA及miR-154的表达量与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),不同浓度组之间的β-catenin mRNA及miR-154的表达差异有统计学意义(P<0.05),结果见图2。说明青蒿琥酯抑制肝星状细胞的增殖可能与β-catenin及miR-154有关,miR-154与Wnt/β-catenin信号通路间可能存在一定相关性。

图2 青蒿琥酯对大鼠肝星状细胞β-c a t e n i n m RNA 及m iR-154表达的影响

3 讨论

肝纤维化是指由各种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程[11]。许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化,而肝纤维化是各种慢性疾病发展成肝硬化的中心环节,抑制肝纤维化的发生对预防肝硬化和肝癌的发生至关重要[12-13]。HSC是肝纤维化发生过程中的关键细胞,HSC被激活后大量增殖分化,在肝内表达过量的细胞外基质,最终引起肝纤维化的发生[14]。因此抑制HSC的活化增殖是治疗肝纤维化的有效方法。本实验前期用青蒿琥酯作用于大鼠HSC发现青蒿琥酯可以有效地促进HSC的凋亡[15]。

经典Wnt/β-catenin信号通路是近年来提出的促HSC凋亡的主要信号转导通路之一[16]。该通路未活化时,β-catenin呈磷酸化状态处于胞浆内,该通路活化后,β-catenin去磷酸化并移位至细胞核内,与T细胞因子/淋巴增强子因子结合,诱导Wnt调控的靶基因的转录,促进肝纤维化发生。有研究报道称抑制Wnt通路可以有效地促进HSC的凋亡,抑制肝纤维化的发生[17-18]。

近年来,microRNA被发现参与许多疾病的病理过程,是疾病潜在的治疗靶点和候选诊断标志物[19]。可以对基因的表达进行转录后调控,影响细胞的分化、增殖、凋亡以及个体生长发育等多种生命活动[20]。有研究发现miR-154在肺纤维化细胞中表达具有较大程度的上调,并且miR-154通过活化Wnt/βcatenin信号通路来促进肺纤维化细胞的增殖,促进肺纤维化的发生[21]。本研究前期发现,活化的大鼠HSC 中miR-154较普通大鼠肝细胞也有较大程度的上调,同时Wnt/β-catenin信号通路在大鼠HSC中处于活化状态,说明miR-154和Wnt/β-catenin信号通路在肝纤维化的发生发展过程中也可能起着重要作用。本实验结果显示,青蒿琥酯作用HSC后,细胞内βcatenin蛋白含量及β-catenin mRNA表达量显著下调,同时miR-154的表达量也明显降低,并呈剂量依赖性,说明青蒿琥酯促进HSC的凋亡与Wnt/βcatenin信号通路及miR-154相关,可能是通过抑制miR-154对Wnt/β-catenin信号通路的调控而发挥作用,抑制miR-154可以抑制其对β-catenin的活化作用,下调β-catenin介导的基因转录,进而促进HSC的凋亡,抑制肝纤维化的发生。本研究结果提示miR-154及Wnt/β-catenin信号通路在青蒿琥酯抑制肝纤维化发生过程中的起着重要作用,但是miR-154与肝纤维化发生的关系、miR-154与β-catenin蛋白之间的关系及miR-154是否是通过对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用来参与肝纤维化还有待我们进一步研究。下一步我们将在大鼠HSC中转染miR-154模拟物及抑制物,观察其对大鼠HSC的增殖、凋亡的影响,观察其对Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达的影响,从而确定miR-154在大鼠肝纤维化发生过程中的关键作用,确定其可以作为治疗肝纤维化的潜在靶点。

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M echanism research on Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibitingm iR-154/茁-catenin in hepatic stellate cell

ZHANG Ying ZHANG Hong PENG Rui WEIDanyun
Department of Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

[Abstract]Objective To investigate themechanism of Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibitingmiR-154/β-catenin in hepatic stellate cell.M ethods HSC-T6 cells were cultured in vitro with different concentrations(0, 5,10,20,30,40μg/mL)of Artesunate on rat hepatic stellate cells.Western blotwas used to detect the expression of β-catenin protein after drug administration.RT-PCR was used to detect the expression ofβ-catenin mRNA and microRNA-154 after drug administration.Results After treatment with artesunate for 24 h,the results of Western blot showed that the expression ofβ-catenin protein significantly decreased in a dose-dependentmanner(P<0.05).The results of RT-PCR showed that the expression ofβ-catenin mRNA and microRNA significantly decreased in a dosedependentmanner(P<0.05).Conclusion Artesunatemay suppress the occurrence of liver fibrosis through inhibiting the expression ofmicroRNA-154 on Wnt/β-catenin signaling pathway.Theremay exist a certain correlation between miR-154 and the wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words]Artesunate;Hepatic stellate cell;miR-154;Wnt/β-catenin signaling pathway;Liver fibrosis

收稿日期:(2015-07-22本文编辑:赵鲁枫)

[通讯作者]张洪(1962.5-),男,硕士,教授,硕士生导师;研究方向:靶向制剂研究,药物作用机制研究,抗肿瘤药物的新剂型及个体化给药研究。

[作者简介]张英(1990.1-),女,武汉大学2013级药剂学专业在读硕士研究生;研究方向:药物作用机制研究。

[基金项目]湖北省自然科学基金项目(2011CDB491)。

[中图分类号]R914.1

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210(2016)01(a)-0035-04

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