微囊化肝细胞移植代偿肝功能的实验研究

孙丽霞　　刘大伟　　刘　芳　　范新娟　　赵国强▲.中山大学附属江门市中心医院病理科，广东江门　59030；.中山大学附属第一医院病理科，广东广州　50080



微囊化肝细胞移植代偿肝功能的实验研究

孙丽霞1刘大伟2刘芳2范新娟2赵国强2▲
1.中山大学附属江门市中心医院病理科，广东江门529030；2.中山大学附属第一医院病理科，广东广州510080

[摘要]目的探讨微囊化肝细胞移植对肝脏功能的代偿能力。方法以D-氨基半乳糖胺（D-gal）作为肝脏毒剂，构建SD大鼠急性肝功能衰竭模型。通过腹腔移植分别植入微囊化肝细胞和游离肝细胞。结合谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）多项血生化指标以及模型动物生存率比较，评估植入细胞对肝功能衰竭的代偿能力。结果细胞植入后12 h开始对模型动物的肝生化指标ALT、AST、TBIL、ALB产生影响，其影响力在细胞植入后24～48 h达到高峰。对比游离肝细胞，微囊化肝细胞移植对各项肝生化指标的改善尤为明显，且动物的存活率最高。结论微囊化肝细胞腹腔内移植有助于提高药物诱导急性肝功能衰竭大鼠的存活率，可明显改善急性肝功能衰竭模型大鼠的肝功能。

[关键词]肝细胞；微囊化；移植；肝衰竭

由各种急性肝损害引起的急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）严重危及人类生命。临床上肝功能重建的途径主要有同位肝移植、生物人工肝技术以及肝细胞移植。肝细胞移植技术前景十分诱人，但因细胞来源复杂，宿主对移植物的免疫排斥反应等问题遭遇发展瓶颈。微囊化包裹肝细胞技术为肝细胞大规模及高活性体外培养提供了新的途径。本实验采用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭模型，经腹腔内移植微囊化的大鼠肝细胞，通过观察分析模型动物肝脏多项生化指标的变化特征、肝组织的病理学变化以及模型动物的存活率，评估植入细胞对肝功能衰竭的代偿能力。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

无菌超净台（苏州超净仪器设备厂）、细胞培养箱（Precision，美国）、细胞培养瓶（Corning美国）、倒置相差显微镜、冷场发射扫描电镜（日本电子株式会社，由中山大学测试中心提供）、全自动生化分析仪（日本日立7170型）、JB-2型恒温磁力搅拌器（上海电磁新泾仪器有限公司）、VORTEX-GENIE2振荡器（Scienlific Industries）、微囊制备仪（自制）、D-氨基半乳糖胺（江苏启东九丰工贸有限公司）、DMEM/F12干粉（美国Gibico公司）、海藻酸钠（国药集团化学试剂有限公司）、壳聚糖（浙江澳兴生物技术有限公司）。

1.2方法

1.2.1动物清洁级雌性SD大鼠34只，6周龄，体重130～150 g，由中山大学实验动物中心提供。标准鼠食，自由饮水，饲养1周后用于实验。

1.2.2肝细胞来源及细胞计数正常大鼠肝细胞株BRL，由中山大学实验动物中心提供。将生长状态良好的BRL肝细胞株用0.25%胰蛋白酶消化，采用4%台盼蓝染色鉴定细胞活性，细胞计数板计算细胞数目，细胞活力98%以上方可用于实验。

1.2.3微囊化肝细胞的制备将2%海藻酸钠/肝细胞混悬液加入自制微囊发生装置（图1），用毛细管破碎法得到微囊化肝细胞，微囊呈圆形，形状较规则、大小较均一，平均直径约0.7mm。

图1　毛细管破碎法实验装置

1.2.4急性肝功能衰竭模型的建立及动物分组将实验所用34只SD大鼠禁食12 h后，以造成肝功能衰竭病变的最佳剂量D-氨基半乳糖胺（D-gal）1.4 g/kg一次性腹腔注射构建大鼠急性肝功能衰竭模型。实验动物随机分为三组：①微囊组（9只）：造模成功后12 h经腹腔移植微囊化正常鼠肝细胞株BRL。②游离组（10只）：造模成功后12 h经腹腔移植游离正常鼠肝细胞株BRL。③对照组（15只）：造模成功后12 h经腹腔移植空白对照PBS溶液。

1.2.5观察与检测指标各组急性肝功能衰竭SD大鼠在腹腔注射D-gal前一刻开始采第1次血，作为正常对照，以后采血时间分别为造模后12、24、48、96、168 h，均剪尾取血，每次约1.5 mL，采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）4项指标，并观察计算各组大鼠7 d存活率。

1.2.6肝脏组织学变化收集各组动物造模后24 h的肝组织标本，10%甲醛固定，HE染色，光镜观察组织变化情况。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1急性肝功能衰竭大鼠模型的生物学特征

2.1.1一般状态的观察造模成功后，大鼠于12 h出现活动明显减少、萎靡、嗜睡，痛觉反应迟钝或消失等现象，24 h可发展至昏睡状态，此时动物开始出现死亡，在24～96 h内动物陆续死亡12只，96 h后大鼠一般状态有所好转。

2.1.2肝功能生化指标的变化大鼠腹腔注入D-gal后，AST、ALT、TBIL逐渐升高，12 h时已出现明显变化，并于24 h达到异常最高点，之后缓慢下降，48 h时有明显改善，进一步恢复于168 h接近正常水平；ALB则逐渐下降，12 h时出现明显异常，并于24 h时达到最低点，48 h时ALB数值逐渐回升，在168 h时恢复至接近正常状态。见表1。

2.1.3模型大鼠肝脏组织病理学特征在D-gal诱导24 h时肝脏病理改变最为明显，肝脏表面淤血严重，质地较软，肝脏组织经HE染色后，镜下观察可见肝小叶结构破坏，肝细胞呈片状坏死，肝窦扩张，充血、出血明显，汇管区及坏死区可见炎症细胞浸润。168 h时肝脏充血消退，表面可见大小不一的结节，镜下观察可见假小叶形成，另有少量肝细胞脂肪变性（图2）。

图2　D-g a l腹腔注射诱导模型大鼠肝脏组织学形态（HE，1 0 0×）

2.2微囊的形态特征

2.2.1光镜形态倒置相差显微镜下观察，微囊呈圆形，形状较规则、大小较均一，平均直径约0.7mm；微囊表面光滑，囊壁透明完整，透过囊壁可见微囊内散在分布均匀的细胞（图3）。

2.2.2扫描电镜低分子量壳聚糖外膜的微囊500倍下可见表面粗糙伴有不等球形隆起；5000倍下可见粗糙表面由粗糙大颗粒组成；50 000～100 000倍下可见每个大颗粒表面由分布均匀且形状大小均一的珊瑚状结构组成，珊瑚状结构之间存在一定的空隙（图4）。

2.3各移植组大鼠的血清学变化

各移植组肝功能在D-gal 1.4 g/kg注射12 h时均已显著异常，此时进行细胞移植。移植后微囊组与游离组较对照组的肝生化指标均有明显改善，但微囊组大鼠的AST、ALT、TBIL逐渐升高，且升高幅度较小，于48 h出现小高峰，游离组大鼠的AST、ALT、TBIL 于24 h异常达到最高峰，之后逐渐下降，于48 h有明显改善，肝功能进一步恢复于168 h时接近正常状态。微囊组大鼠的ALB在细胞移植后未见明显下降，游离组大鼠的ALB逐渐下降，并于24 h达到最低点。见表1。各移植组肝生化指标动态曲线见图5。

图3　载细胞微囊（倒置相差显微镜，4 0×）

图4　微囊表面珊瑚状结构

表1　三组大鼠肝功能变化（±s）

表1　三组大鼠肝功能变化（±s）

注：与游离组同时间比较，*P＜0.05；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALB：白蛋白；TBIL：总胆红素

组别　0 h　12 h　24 h　48 h　96 h　168 h对照组AST（U/L）ALT（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）游离组AST（U/L）ALT（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）微囊组AST（U/L）ALT（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）80.60±9.85 47.30±8.97 0.21±0.07 39.80±3.46 501.20±23.45 398.74±17.25 2.89±0.11 35.50±4.36 2448.13±2892.30 2240.95±2801.45 12.82±2.88 20.43±1.43 79.30±8.35 53.20±5.69 0.09±0.02 40.50±3.96 500.90±25.60 403.50±20.63 2.57±0.13 36.93±2.67 1378.56±2437.54 1759.76±3601.48 5.22±0.94 30.50±1.44 546.33±41.77 564.40±22.42 1.60±0.20 35.87±2.93 90.80±2.92 48.33±7.01 0.34±0.40 37.43±0.57 2016.83±1043.25 2097.41±721.21 9.26±1.77 30.66±2.82 80.40±7.94 47.20±9.63 0.45±0.02 42.10±2.53 499.70±23.72 409.63±10.75 2.99±0.09 35.95±5.25 536.45±424.31 336.45±451.84 4.05±0.97 31.70±2.22 218.62±25.31 91.60±11.20 0.45±0.23 36.33±0.76 80.20±1.78 53.24±7.77 0.17±0.10 40.22±2.69 625.11±338.07*943.74±121.06*4.18±1.18*37.03±2.41*1380.71±357.80 929.54±2209.71*4.96±0.62 36.77±1.64*191.38±10.16 44.65±4.70 0.32±0.26 35.88±2.15*85.80±6.91 47.94±14.60 0.51±0.27 41.29±3.41

图5　细胞移植后各组肝生化指标水平（AST、ALT、TB I L、ALB）的变化

2.4各移植组肝脏形态学变化

细胞移植后12 h，微囊组大鼠较游离组大鼠的肝脏有明显改善，镜下表现为肝窦轻度扩张，肝细胞轻度空泡变性，而游离组动物肝脏则表现为肝细胞索结构紊乱，肝细胞大片坏死并空泡变性，血管充血出血明显（图6）。168 h时各组动物肝脏均可见假小叶形成，假小叶内肝细胞基本正常。

图6　细胞移植后1 2 h肝脏组织学形态（HE，1 0 0×）

2.5各移植组大鼠存活率统计

7 d存活率分别为微囊组77.8%（7/9），游离组50.0%（5/10），对照组20.0%（3/15），微囊组大鼠的生存率明显高于其他两组。

3　讨论

肝细胞移植已成为继原位肝移植后又一治疗肝衰竭和肝先天性代谢疾病的有效治疗措施，它可以提供急性肝功能损害时的代谢支持，或者替代受者的肝细胞功能，使急性肝衰竭患者的受损肝细胞再生得到足够支持的肝功能或使患者渡过急性肝衰的难关，从而为原位肝移植赢得时间，同时也是一种过渡性治疗手段，作为等待供肝患者维持生命的桥梁。但同种异体或异种肝细胞移植又不可避免地发生免疫排斥反应而影响细胞移植的成功率。

微囊是用亲水性高分子材料与细胞混匀，从喷嘴射出时在组织细胞簇表面成型，形成直径50～800μm包裹组织细胞的球囊[1]。而细胞微囊化是采用无毒高分子聚合物膜材料包裹细胞，形成直径数十至数百微米微囊的技术[2]。微囊制备技术已广泛应用于糖尿病、帕金森症、镇痛、肿瘤等疾病治疗过程中[3-7]。

将肝细胞用具有选择性的半透膜包裹或隔离，细胞生存所必需的营养物质、代谢产物及生物活性物质等能通过半透膜自由出入，而宿主免疫细胞、免疫球蛋白等大分子物质则不能通过[8-10]。因此，囊内肝细胞可不受宿主的免疫排斥而正常存活，发挥其生物学功能。微囊具有体积小、制作方法简单等优点，并且膜内细胞的自由空间可控制[11]，微囊还可提供细胞附着的基质，使肝细胞之间相互接触，并形成一种三维结构[12]，微囊的这种三维结构通过改善细胞间的相互作用，在维持肝功能方面起重要作用。

随着微囊化人工细胞技术研究的不断深入，各种制作工艺也日趋完善。在本实验中，笔者选用了容易控制、设备简单和经济的毛细管破碎制囊体系，其原理为当海藻酸钠/细胞混悬液经毛细管流出时，在高频振荡器的作用下克服表面张力，迅速破碎为大小较均匀一致的微球形液滴，然后在重力作用下垂直落入氯化钙溶液中，并迅速凝固成海藻酸钙微球。成囊装置主要由高频振荡器、磁力搅拌器组成，可以通过改变振荡针孔径、振荡频率和流速来控制微球的直径。

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊具有良好的生物相容性和机械强度，是当前发展最广泛、最成熟的技术[13-15]，但聚赖氨酸是人工合成的阳离子聚合物，价格昂贵，难以实现其广泛应用。相比之下，壳聚糖是天然的高分子物质，具有优异的生物相容性[16]，价格便宜，无免疫原性，在医疗领域有着广泛的应用前景，是制作微囊的理想材料[17]。Marcotte等[18]研究发现：壳聚糖相对分子质量对微囊的强度和控释性的影响是很重要的。有研究采用亚硝酸盐氧化法制备了不同分子质量的壳聚糖，发现高分子质量壳聚糖制备的微囊膜薄接近透明，微囊十分脆弱，若悬浮液提供的浮力消失，微囊很容易在自身重力作用下破碎[19]；另一方面通过降低壳聚糖分子质量形成的微囊膜厚、弹性强，球形圆整，囊边缘光滑不变形。King等[20]也发现随着壳聚糖相对分子质量的降低，制备的微胶囊强度提高。本实验中选用的是低分子量壳聚糖，制备的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠（ACA）微囊能为囊内细胞生长提供良好的微环境，且具有较好的生物相容性和物理稳定性。

本实验应用微囊化技术将BRL细胞通过腹腔移植于D-gal诱发的急性肝功能衰竭大鼠模型中，微囊组与游离组比较，24 h各项生化指标均有显著差异（P＜0.05），48 h生化指标AST、ALB有显著差异（P＜0.05），96 h ALB指标有显著差异（P＜0.05）。由此可以看出，微囊化肝细胞移植显著改善了急性肝功能衰竭模型大鼠的AST、ALT、TBIL、ALB等生化指标，并提高了动物生存率，肝组织形态学也显示微囊组较游离组的肝脏病理变化有明显改善。

综上所述，利用自制微囊制备仪制备的ACA微囊具有良好的通透性，肝细胞所分泌的小分子生物活性物质、ALB等可透过微囊发挥肝细胞的功能，起到一定的肝功能代偿作用。肝细胞微囊化技术具有广泛的应用前景，但微囊易于破碎及存活时间短等问题有待进一步研究。

[参考文献]

[1]薛毅珑，王鲁宁，何立敏，等.APA微囊化人工细胞治疗疾病的研究[J].自然科学进展，2004，10（4）：299-303.

[2]Orive G，Hernandez RM，Rodriguez Gascon AR，et al.History，challenges and perspectives of cellmicroencapsulation[J].Trends Biotechnol，2004，22（2）：87-92.

[3]Cui H，Tucker-burden C，Cauffiel SM，et al.Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabeticmice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets[J].Transplantation，2009，88（2）：160-169.

[4]Abalovich AG，Bacque MC，Grana D，et al.Pig pancreatic islet transplantation into spontaneously diabetic dogs[J]. Transplant Proc，2009，41（1）：328-330.

[5]Grandoso L，Ponce S，Manuel I，etal.Long-term survival of encapsulated gdnf secreting cells implanted within the striatum ofparkinsonized rats[J].Int JPharm，2007，343（1-2）：69-78.

[6]张建军.转脑啡肽基因移植细胞微囊化对大鼠慢性周围神经损伤的镇痛作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（31）：6228-6232.

[7]Wu J，Ding D，Ren G，et al.Sustained delivery of endostatin improves the efficacy of therapy in lewis lung cancermodel[J].JControl Release，2009，134（2）：91-97.

[8]Haque T，Chen H，OuyangW，et al.In vitro study of alginate-chitosan microcapsules：an alternative to liver cell transplants for the treatment of liver failure[J].Biotechnol Lett，2005，27（5）：317-322.

[9]Umehara Y，Hakamada K.Improved survival and ammonia metabolism by intraperitoneal transplantation of microen capsulated hepatocyte in totally hepatectomizerats[J]. Surgery，2001，130（3）：513-520.

[10]Prakash S，Jones ML.Artificial cell therapy：new strategies for the therapeuticdeliveryof livebacteria[J].JBiomed Biotechnol，2005，2005（1）：44-56.

[11]Grigore A，Sarker B，Farbry B，et al.Behavior of encapsulated MG-63 cells in RGD and gelatine-modified alginate hydrogels[J].Tissue Eng Part A，2014，20（15-16）：2140-2150.

[12]DixitV，ArthurM.Improved function ofmicroencapsulated hepatocytes in ahybrid bioartificial liversupportsystem[J]. Artif Organs，1992，16（4）：336-341.

[13]Darrabie MD，Kendall WF Jr，Opara EC.Characteristics of Poly–L-Ornithine-coated alginatemicrocapsules[J]. Biomaterials，2005，26（34）：6846-6852.

[14]Schaffellner S，Stadlbauer V，Stiegler P，etal.Porcine islet cells microencapsulated in sodium cellulose sulfate[J]. Transplant Proc，2005，37（1）：248-252.

[15]张阳德，马仁，何剪太，等.微囊化同系、同种异体、异种肝细胞腹腔移植对急性肝衰的治疗作用[J].中华实验外科杂志，2001，18（1）：47-49.

[16]覃昱，裴国献，谢德明，等.壳聚糖海藻酸钠微球与骨髓基质细胞相容性实验研究[J].中国矫形外科杂志，2003，11（13）：901-903.

[17]Bartkowiak A，Hunkeler D.New microcapsules based on oligoelectrolyte complexation[J].Ann N Y Acad Sci，1999，18（875）：36-45.

[18]Marcotte N，Polk A，Goosen MF，et al.Kinetics of protein diffusion from a poly（d，l-lactide）reservoir system[J].J Pharm Sci，1990，79（5）：407-410.

[19]ChoiWS，Ahn KJ，Lee DW，et al.Preparation of chitosan oligomers by irradiation[J].Polym Deg Stab，2002，78（3）：533-538.

[20]King GA，Daugulis A，Faulkner P，et al.Alginate-Polylysine microcapsules of controlled membrane molecular weight cutoff formammalian cell culture engineering[J]. Biotechnol Prog，1987，3（4）：231-240.

Experimental com pensatory ability of hepatic failure by transp lantation of m icroencapsulated hepatocytes

SUN Lixia1LIU Dawei2LIU Fang2FAN Xinjuan2ZHAOGuoqiang2▲
1.Department of Pathology,Jiangmen Central Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University,Guangdong Province, Jiangmen 529030,China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

[Abstract]Objective To investigate the compensatory ability ofmicroencapsulated hepatocyte transplantation on acute hepatic failure rats.M ethods An acute hepatic failure ratmodelwas induced by celiac injection of D-gal.Microencapsulated and non-microencapsulated rat hepatocytes BRL were transplanted into acute hepatic failuremodel rat by abdominal cavity administration,respectively.The blood levels of ALT,AST,TBIL,ALB as well as survival rate of host rats were comparably analyzed to evaluate the compensatory ability ofmicroencapsulated hepatocytes for the prostrate liver.Results Levels of ALT,AST,TBIL and ALB were influenced in acute hepatic failure ratmodel at 12 h after transplantation,and peaked between 24-48 h.Compared with the non-microencapsulated cell,the level of liver biochemical index improved obviously and the survival rate was the highest inmicroencapsulated hepatocytes.Conclusion After microencapsulated hepatocyte transplantation,the survival rate of acute liver failure rats induced by D-gal increased and the liver function improved obviously.

[Key words]Hepatocyte;Microencapsulated;Transplantation;Hepatic failure

收稿日期：（2015-10-10本文编辑：程铭）

通讯作者▲

[作者简介]孙丽霞（1982.8-），女，硕士研究生；研究方向：分子病理与肿瘤病理。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目（30170473）；广东省自然科学基金资助项目（04009326）。

[中图分类号]R318

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0004-05