冠心Ⅴ号合剂干预急性心肌梗死模型大鼠心室重构及心肌TLR4 信号通路研究*

左可可，柯 峰，顾 宁

(1．南京市中医院，南京 210001;2．南京中医药大学第三附属医院，南京 210001)

冠心Ⅴ号合剂干预急性心肌梗死模型大鼠心室重构及心肌TLR4 信号通路研究*

左可可1，柯 峰1，顾 宁2△

(1．南京市中医院，南京 210001;2．南京中医药大学第三附属医院，南京 210001)

目的:观察冠心Ⅴ号合剂对急性心肌梗死(AMI)模型大鼠心室重构及心肌TLR4信号通路的影响。方法:雄性SD大鼠56只，采用冠状动脉左前降支结扎法建立急性心肌梗死模型，分别给予冠心Ⅴ号合剂小剂量(0.5 g/ml)、中剂量(1 g/ml)、大剂量(2 g/ml)及血脂康胶囊连续干预4周，以心脏彩超观察心脏结构及心功能，荧光定量PCR法检测TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达。结果:模型组实验大鼠心功能明显下降，梗死区心肌组织TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达上调，与空白组、假手术组比较差异有统计学意义;药物干预组各组上述指标均低于模型组;冠心Ⅴ号合剂大剂量组上述指标低于余治疗组，差异有统计学意义。结论:冠心Ⅴ号合剂能够抑制急性心肌梗死大鼠TLR4信号通路并改善心室重构。

心肌梗死;心室重构;冠心Ⅴ号合剂;TLR4信号通路

Toll样受体4(TLR4)是第一个被发现的哺乳动物TLR，是天然免疫系统的一种模式识别受体，参与急性心肌梗死(AMI)后心室重构的发生发展。冠心Ⅴ号合剂是南京中医药大学第三附院的院内制剂，已在临床应用多年。本课题组前期研究表明，该药可改善心梗后大鼠的血流动力学，促进缺血心肌细胞的心肌收缩力恢复，改善心肌细胞的能量代谢，降低心肌部位的血管紧张素1受体和升高AT2受体，在一定程度上改善心梗后大鼠的心室重构［1］。本研究进一步从分子生物学角度探讨冠心Ⅴ号合剂通过抑制TLR4信号通路、干预心肌梗死后心室重构的作用机制。

1 材料

1.1 动物

健康雄性 SD大鼠56只，6～7周龄，体质量(220±10)g，由南京中医药大学动物实验中心购于浙江省医学科学院实验动物中心(许可证号SUXK (浙)20080033)。

1.2 主要药品、试剂和仪器

冠心Ⅴ号合剂由党参、麦冬、丹参、赤芍、制五味子、地黄组成，由南京中医药大学第三附属医院药剂科制备(苏药制字Z04000795)。血脂康胶囊由北大维信生物科技有限公司提供(批准文号国药准字Z10950029)，引物由上海生工生物有限公司提供。逆转录试剂盒、荧光定量 PCR试剂盒、Trizol均由TaKaRa公司提供。主要仪器设备包括小动物呼吸机(ALC-V8)，上海奥尔科特生物科技有限公司;心电图机，SHANGHAI KOHDEN Medical Electronic Instrument Corporation;小动物高频彩色超声仪(VisualSonics Vevo2100)，探头MS-250，频率21 MHz;7500 Real-Time PCR System，Applied Biosystems公司生产。

2 方法

2.1 分组与动物模型制备

56只SD大鼠适应性喂养1周后称重，取14只随机分为空白组与假手术组，剩余大鼠行左冠状动脉前降支结扎术造模。造模动物经10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉后，四肢皮下连接心电图机电极，记录标准Ⅱ导联心电图，经口行气管插管后接小动物呼吸机通气，潮气量7～8 ml，吸呼比3∶2，呼吸频率90次/min。沿左胸第3～4肋间水平依次剪开皮肤，逐层分离皮下组织、肌肉，暴露心脏，撕开心包，用6-0号线于左心耳下缘2 mm缝扎左前降支;观察到结扎线以下心肌变白，心肌运动减弱(连接心电图见Ⅱ导联ST段上抬0.2 mV)提示心肌梗死。逐层关闭胸腔(边缝合边挤压胸腔内的残余气体)。假手术组手术方法同前，但在该血管下穿线后不打结。空白对照组不作任何手术。造模成功大鼠随机分为模型组、冠心Ⅴ号合剂小剂量组、冠心Ⅴ号合剂中剂量组、冠心Ⅴ号合剂大剂量组、血脂康组。

2.2 给药方法

除空白组外的6组大鼠于术后24 h开始灌胃，每只大鼠灌胃体积为1 ml/(100 g·d)。冠心Ⅴ号合剂小剂量组含生药量0.5 g/ml，冠心Ⅴ号合剂中剂量组含生药量1 g/ml，冠心Ⅴ号合剂大剂量组含生药量2 g/ml，血脂康组将血脂康胶囊溶为12.5 mg/ ml灌胃，每日1次;模型组、假手术组均给予等容量生理盐水灌胃，每日1次。连续灌胃28 d后，7组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉处死。

2.3 心脏超声心动图评价心功能

各组大鼠在造模第28天时行超声心动图检查，使用超声仪探头频率21 MHz。大鼠麻醉后固定于鼠板上，取胸骨旁左室长轴切面，由二维超声引导M型曲线测量EF值、FS值、左室质量(LVmass)，计算大鼠体表面积 (BSA，m2)=0.09x［体质量(kg)］2/3;左室心肌质量指数(LVMI，g/m2)=实测LVM/BSA。

2.4 荧光定量PCR检测

各组大鼠随机取5只进行检测。称取梗死区心肌组织50 mg，用Trizol法提取总RNA，并用紫外分光光度仪测定RNA浓度及A260/A280值，所测得样品吸光度A260/A280为1.8～2.0。逆转录后应用荧光定量PCR法检测TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达(引物见表1)。反应条件依据Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System设定，退火温度为58℃。

2.5 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计分析，实验数据经正态性检验后以均数±标准差(±s)表示，组间多样本均数比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

实验过程中，实验大鼠因呼吸暂停死亡8只，心脏骤停死亡9只，灌胃死亡1只。最终纳入统计的动物数量为空白组7只，假手术组6只，模型组、冠心Ⅴ号合剂小剂量组、冠心Ⅴ号合剂中剂量组、冠心Ⅴ号合剂大剂量组、血脂康组各5只。

3.1 心脏彩超检测结果

表1图1显示，与空白组、假手术组比较，模型组实验大鼠心功能指标EF、FS值明显下降，LVMI增高，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，各药物干预组EF、FS增高，LVMI下降，差异有统计学意义(P＜0.05);与血脂康组比较，冠心Ⅴ号大剂量组EF、FS增高，LVMI下降更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠治疗28 d后心脏彩超比较(±s)

表1 各组大鼠治疗28 d后心脏彩超比较(±s)

注:与空白组、假手术组比较:*P＜0.05;与模型组比较:△P＜0.05;与血脂康组比较:▲P＜0.05

组别 鼠数 EF(%) FS(%) LVMI(g/cm2)空白组773.911±1.023 43.488±0.521 0.134±0.005假 手 术 组 6 71.410±1.100 40.221±1.971 0.171±0.006模型组 5 52.041±1.839* 27.759±1.058* 0.240±0.013*血 脂 康 组 5 60.885±0.936△ 33.621±1.565△ 0.168±0.006△冠 心 Ⅴ 号 合 剂 小 剂 量 组 5 59.130±1.329△ 31.874±1.129△ 0.179±0.006△冠 心 Ⅴ 号 合 剂 中 剂 量 组 5 60.817±0.911△ 34.074±1.037△ 0.168±0.008△冠 心 Ⅴ 号 合 剂 大 剂 量 组 5 62.672±1.404△▲ 35.258±0.807△▲ 0.157±0.006△▲

3.2 荧光定量PCR检测结果

表2显示，模型组大鼠梗死区心肌组织TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达上调，与空白组、假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.05);药 物 干 预 组 各 组 TLR4mRNA、 Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达均低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05);冠心Ⅴ号各剂量组TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达与药物浓度成反比，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 实验药物对AMI大鼠心肌组织TLR4、Myd88、NF-κB mRNA表达的影响(±s)

表2 实验药物对AMI大鼠心肌组织TLR4、Myd88、NF-κB mRNA表达的影响(±s)

注:与正常组、假手术组比较:*P＜0.05;与模型组比较:△P＜0.05;与血脂康组比较:▲P＜0.05

组别 鼠数 TLR4mRNA Myd88mRNA NF-κBmRNA空白组50.5 0.5 0.5假 手 术 组 5 1.194±0.040 1.081±0.020 1.094±0.015模型组 5 2.078±0.129* 1.926±0.047* 1.986±0.098*血 脂 康 组 5 1.485±0.006△ 1.450±0.024△ 1.475±0.021△冠 心 Ⅴ 号 合 剂 小 剂 量 组 5 1.729±0.133△ 1.682±0.087△ 1.667±0.054△冠 心 Ⅴ 号 合 剂 中 剂 量 组 5 1.477±0.053△ 1.430±0.053△ 1.465±0.045△冠 心 Ⅴ 号 合 剂 大 剂 量 组 5 1.292±0.033△▲ 1.317±0.029△▲ 1.357±0.048△▲

图1 各组大鼠心脏彩超

4 讨论

TLR4是天然免疫系统的一种模式识别受体，介导机体的天然免疫反应。TLR4介导的信号传导可分为髓样分化蛋白88(MyD88)依赖性和非依赖性2个途径，MyD88途径主要介导炎性细胞因子产生。TLR4与配体结合后使其本身二聚化，然后通过TIR结构域与MyD88羧基端相互作用，MyD88氨基端的结构域与丝/苏氨酸IRAK的氨基端相互作用，引起IRAK自身磷酸化，活化肿瘤坏死因子受体 6 (TRAF-6)。活化后的TRAF-6通过适配体蛋白激活TGF-β活化激酶1，最终通过活化核因子抑制蛋白I-κB导致NF-κB的激活和转位，NF-κB的激活可诱导炎性细胞因子的合成和释放。研究表明，动脉粥样硬化斑中TLR4的表达明显增高，并进一步激活NF-κB诱导与冠状动脉粥样硬化相关炎症细胞因子的合成与释放［2］。TLR4基因缺乏的大鼠心肌梗死范围及炎性反应明显减少［3］，抑制TLR下游信号通路分子，如MyD88、NF-κB也能减轻心肌缺血再灌注损伤，表明TLR/MyD88/NF-κB信号通路的激活参与缺血再灌注心肌损伤的发生和进展［4-5］。TLR4可能成为干预心肌梗死后心室重构炎症反应的目标，干预TLR4信号可能抑制炎症反应，值得进一步研究。

中医药在TLR4信号通路的治疗中发挥着一定的作用。丹参酮是丹参的主要有效成分，已有研究［6］证实，丹参酮ⅡA可抑制 LPS诱导的EAhy926细胞TLR4表达，从而干预TLR4/NF-κB信号通路激活。张云［7］等研究表明，由丹参总酚酸、三七总苷和银杏叶黄酮组成的活血安心方，通过抑制 TLR4-NFκB-TNFα通路激活来显著改善AMI大鼠心肌缺血损伤导致的心脏形态结构和功能异常。

中药“冠心Ⅴ号合剂”是获得江苏省食品药品监督管理局批准的医院院内制剂(苏药制字Z04000795)，已在临床应用多年。方中党参补中益气、健脾益肺，麦冬养阴润燥、清心除烦，五味子敛肺止汗、生津止渴、补肾宁心，赤芍行瘀止痛、凉血消肿，丹参活血祛瘀、安神宁心，生地清热凉血、养阴生津，本方6味药物合用，益气、养阴、凉血、化瘀相得益彰。现代药理研究表明，党参水溶液可调节心肌收缩力，增强心脏泵血功能，增加心输出量，从而对缺血再灌注损伤后的心肌组织起到营养保护作用［8］。赤芍总苷可稳定心肌细胞膜，清除自由基和抑制心肌细胞早期凋亡，保护心肌细胞［9］，而赤芍有效成分赤芍801可降低AMI大鼠血清炎症因子TNF-α水平，抑制缺血心肌组织COX-2、ICAM-1表达，从而减轻AMI大鼠心肌损伤［10］。麦冬通过抑制p-Smad2/3和Smad2/3及TGF-β1蛋白表达，减少大鼠心肌纤维化［11］。丹参水溶性提取物具有增强冠状动脉血流量、抗脂质过氧化、抑制血小板聚集、血栓形成及改善微循环等作用［12-13］。前期研究表明，冠心Ⅴ号对心肌组织具有一定的保护作用，但未明确其作用机制。本研究结果显示，AMI大鼠心功能明显下降，心梗死区心肌组织 TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表达上调，治疗后各组心功能显著改善，基因表达明显下降，治疗效果与药物浓度成反比，表明冠心Ⅴ号合剂能够抑制 TLR4-Myd88-NF-κB信号通路，并改善心室重构，以冠心Ⅴ号合剂大剂量组疗效最优。

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Guanxin V Mixture Intervention on the Ventricular Remodeling and Myocardial TLR4 Signal Pathway in Rat Model of Acute Myocardial Infarction

ZUO Ke-ke1，KE Feng1，GU Ning2△
(1．Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2．The Third Afficiated Hospital Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210001，China)

Objective:Observing the effect of Guanxin V mixture on ventricular remodeling and TLR4 signaling pathway in myocardial Tissue in rats with acute myocardial infarction．Methods:56 male SD rats，establishing the model of acute myocardial infarction by left anterior descending coronary artery ligation．All of them were treated with low Guanxin V mixture dose(0.5 g/ml)，medium dose(1 g/ml)，high dose(1 g/ml)and Xuezhikang Capsule for 4 weeks，To observe the cardiac structure and function by echocardiography，Fluorescence quantitative PCR technique was used to detect the expression of TLR4mRNA，Myd88mRNA，NF-κBmRNA．Result:Compared with the normal group and sham operation group，the expression of TLR4mRNA，Myd88mRNA，NF-κBmRNA in model rats were up-regulation，the difference were statistically significant，Drug intervention group were lower than those in the model group，the difference were statistically significant．The mRNA expression of Guanxin V mixture groups are proportional to the concentration of each drug，the difference was statistically significant．Conclusion:Guanxin V mixture can inhibit TLR4 signal pathway，and improve ventricular remodeling．

Myocardial infarction;Ventricular remodeling;Guanxin V mixture; TLR4 signal pathway

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0181-03

2015-06-12

南京市卫生局医学科技发展重点项目(201108005)-冠心Ⅴ号合剂改变剂型及干预心肌TLR4信号通路改善AMI后心室重构机制研究;江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ13_ 0611)-基于心肌TLR4信号通路冠心Ⅴ号干预AMI后心室重构机制

左可可，女，河南人，从事中医及中西医结合心血管疾病的临床与基础研究。

△通讯作者:顾 宁，男，教授，主任医师，医学博士，Tel:025-52276242，E-mail:guning@medmail．com．cn。