Eμ-VH启动子调控c-Myc表达慢病毒载体的构建及其体外功能

陈琳，陈燕，肖东

（南方医科大学，广州510515）

Eμ-VH启动子调控c-Myc表达慢病毒载体的构建及其体外功能

陈琳，陈燕，肖东

（南方医科大学，广州510515）

目的 构建人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控癌基因c-Myc表达的慢病毒载体（pEMIR），并探讨其体外功能。方法 以pLV-c-Myc-IRES-增强绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，经PCR扩增、酶切后得到pEVCHR；以pEVCHR为模板，PCR扩增、酶切后得到慢病毒载体pEMIR，并行测序和酶切鉴定。将pEMIR分别瞬时转染入人源胚胎肾细胞293T、人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10），倒置荧光显微镜检测各细胞EGFP和单体红色荧光蛋白（mRFP）的表达，用qRT-PCR法检测细胞内c-Myc mRNA表达，用Western blotting法检测293T细胞c-Myc蛋白表达。结果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段电泳结果与预测值4 129 bp相符，Vector DNA电泳可见一条带与预测值8 561 bp相符；pEMIR酶切并电泳的结果与理论预测值相符；对pEMIR质粒进行测序，结果与预期相符，证明pEMIR构建成功。三种细胞经pEMIR转染后，倒置荧光显微镜下可见绿色和红色荧光，同时转基因c-Myc表达正常。结论 成功构建Eμ-VH启动子调控c-Myc表达的慢病毒载体，体外实验证明该载体能够在人正常细胞和肿瘤细胞中均可发挥功能。

Eμ-VH启动子；c-Myc癌基因；慢病毒载体；弥漫大B细胞淋巴瘤

目前，用于肿瘤研究的动物模型绝大多数是基于遗传工程的小鼠［1］，极度缺乏人类肿瘤大动物模型。小型猪在常用大型实验动物中具有诸多优势［2］。在小鼠转基因过表达c-Myc，可诱发淋巴瘤［3～5］，且耗时较短。为此我们拟基于小型猪创制人类淋巴瘤模型。目前，慢病毒载体法已成功用于制备转基因猪［6］。2015年3～12月，本研究构建人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控c-Myc基因表达的慢病毒载体（pEMIR），并对载体的体外功能进行初步验证，为制备转基因猪奠定坚实基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂 携带人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH的载体pEμ-VH-miR155由美国俄亥俄州立大学Carlo教授惠赠，载体pLV-c-Myc-IRES-增强绿色荧光蛋白（EGFP）（pEMIG）由中国上海生命科学研究院肖磊研究员惠赠，pHIV-H2BmRFP由美国加州大学的Zena教授惠赠，慢病毒载体pCD550A-1购自System Biosciences（SBI）公司。高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、In-Fusion克隆试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；脂质体转染剂Lipofectamine2000、高糖DMEM、Opti-MEM I Medium和DMSO等购自Invitrogen公司；培养瓶及培养板等购自Corning公司；其余试剂为国产或进口化学纯或分析纯。人源胚胎肾细胞293T来源和培养方法见文献［7］，人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10）由南方医科大学赵彤教授惠赠。以上细胞所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM。

1.2pEMIR的构建 pEμ-VH-miR155进行测序。以质粒pLV-c-Myc-IRES-EGFP为模板，PCR扩增目的基因c-Myc，In-Fusion克隆至利用EcoR V／Sal I酶切的pEμ-VH-miR155中，构建载体pEVC；以pEVC为模板，PCR扩增目的基因Eμ-VH-c-Myc，In-Fusion克隆至利用Hpa I酶切的pHIV-H2BmRFP中，构建载体pEVMHR；以pEVMHR为模板，PCR扩增目的基因Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP，In-Fusion克隆至利用Nhe I／CIa I双酶切的pCD550A-1中，最终获得慢病毒表达载体pEMIR。次日挑选单菌落，提取质粒并行测序和酶切鉴定。

1.3pEMIR体外功能检测 采用LipofectamineTM2000将pEMIR、pCD550A-1（阴性对照）在六孔板内分别瞬时转染入293T、OCL-LY3和OCL-LY10细胞；同时将pEMIG（阳性对照）瞬时转染入293T细胞；以上转染均至少设两个复孔。转染24～48 h在倒置荧光显微镜下观察细胞荧光情况，如果pEMIR瞬时转染，293T、OCL-LY3和OCL-LY10细胞在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，则证明转染成功。然后分别提取以上细胞总RNA，按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书，逆转录成cDNA后，qRT-PCR法检测细胞内c-Myc mRNA表达，采用2-ΔΔCt公式计算基因相对表达量。转染72 h提取293T细胞的总蛋白，用Western blotting法检测293T细胞c-Myc蛋白表达。用Image lab软件分别对蛋白条带进行灰度分析，用公式计算实验组相对于对照组的表达倍数作为实验组的相对表达量。以上实验重复3次，取平均值。

1.4统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料用±s表示，比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1pEMIR构建结果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段电泳结果与预测值4 129 bp相符，Vector DNA电泳可见一条带与预测值8 561 bp相符；pEMIR酶切并电泳的结果与理论预测值相符；pEMIR质粒测序结果与预期相符。证明pEMIR构建成功。

2.2pEMIR体外功能检测结果 pEMIR瞬时转染293T、OCL-LY3和OCL-LY10细胞，在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，证明转染成功。瞬时转染48 h后倒置荧光显微镜下也可见红色荧光（目的基因表达）。转染pEMIR后，293T、OCL-LY3和OCL-LY10细胞c-Myc mRNA相对表达量（18.86±0.42、5 928.90±125.13、238.92±6.71）均高于转染pCD550A-1（均为1.00±0.00），P均＜0.05。转染pEMIG后，293T细胞c-Myc mRNA相对表达量为368.72±8.66。转染pEMIR、pEMIG后293T细胞内c-Myc mRNA相对表达量高于转染pCD550A-1（P均＜0.05）。转染pCD550A-1、pEMIR、pEMIG后72 h，293T细胞c-Myc蛋白相对表达量分别为0.07 ±0.01、0.15±0.01、3.05±0.05，转染pEMIR、pEMIG后293T细胞内蛋白相对表达量高于转染pCD550A-1（P均＜0.05）。

3　讨论

慢病毒属于逆转录病毒的一种，不仅可以高效感染处于分裂期的细胞，而且可以感染非分裂期的细胞；借助慢病毒可将其携带的外源目的基因高效整合进宿主细胞基因组中，外源目的基因可在细胞内长期稳定地表达。目前，慢病毒载体法已成功用于制备转基因猪。利用慢病毒载体法制作转基因猪，操作比较简单，而且能够确保研究者在很短的时间内获得目标转基因动物，具有高的胚胎存活率和高的转基因效率［6］。

本课题组拟采用慢病毒载体法建立小型猪淋巴瘤模型。因为以小鼠为模型的实验结果表明相对于其他实体肿瘤而言，淋巴瘤模型更容易诱发，而且耗时比较短。在淋巴瘤中，非霍奇金淋巴瘤（NHL）占多数，我国约为90%，临床上大多数NHL为B细胞型，约占总数的70%～85%，所以本课题组基于B淋巴细胞建立转基因猪淋巴瘤模型。

c-Myc基因最早发现于伯基特淋巴瘤患者中，是一个非常强的促癌基因，在许多类型肿瘤中的表达都上调；c-Myc蛋白属于Myc转录因子家族，此家族还包括N-Myc和L-Myc基因；c-Myc被认为调节15%基因的表达。另外，已经有研究证实，在转基因小鼠的特定脏器过表达c-Myc，可以诱导相应脏器肿瘤的发生，比如淋巴瘤、肝癌［8，9］和乳腺癌［10，11］等。而且本课题组之前研究结果显示，单一过表达c-Myc基因就可以使小型猪胚胎成纤维细胞发生恶性转变。此外，目前基于过表达c-Myc的转基因小鼠和斑马鱼，已经分别建立了小鼠和斑马鱼［12］的淋巴瘤模型。本课题组拟应用慢病毒载体法，建立B细胞特异表达c-Myc的转基因猪，以实现在转基因小型猪B淋巴细胞特异性过表达c-Myc转基因，进而导致转基因小型猪发生淋巴瘤，并以期基于该转基因猪创制淋巴瘤小型猪模型。希望能够更加真实地揭示人类肿瘤发病情况，更真实地模拟人类肿瘤发生、发展、转移及复发的整个动态过程，为生物制药的研发和医学临床前研究提供更好的研究对象。

本研究为实现猪B淋巴细胞特异转基因过表达c-Myc，采用人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控c-Myc和报告基因mRFP表达。mRFP一方面可用来监测启动子Eμ-VH是否有活性，另一方面也有助于利用流式细胞仪分选出转基因过表达c-Myc的细胞以做进一步相关分析。此外，载体pEMIR中亦引进了受泛表达启动子PGK调控的报告基因GFP，GFP利于慢病毒生产和病毒滴度测定，同时借助GFP也有助于转基因猪可视化筛选和鉴定。

本研究成功构建了人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控c-Myc表达的慢病毒载体pEMIR。通过pEMIR瞬时转染293T、OCL-Ly3和OCL-Ly10细胞证实，启动子Eμ-VH可以正常调控c-Myc和mRFP表达。数据证实载体pEMIR在人正常细胞和肿瘤细胞中均可发挥功能。总之，pEMIR的成功构建为借助慢病毒载体法制备B淋巴细胞特异过表达c-Myc的转基因猪打下了良好基础。

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Construction and function of a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter

CHEN Lin，CHEN Yan，XIAO Dong

（1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Objective To construct a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of human B lymphocytespecific Eμ-VH promoter（pEMIR），and to investigate its function.Methods Firstly，taking pLV-c-Myc-IRES-EGFP as a template，after PCR amplification and enzyme digestion，we got pEVCHR.Secondly，taking plasmid pEVCHR as a template，after PCR amplification and enzyme digestion，we got a lentiviral vector pEMIR.pEMIR was transiently transfected into human embryonic kidney cells 293T and human diffuse large B-cell lymphoma cell line（OCL-LY3 or OCL-LY10）.The expression of enhanced green fluorescent protein（EGFP）and mono-red fluorescence protein（mRFP）was detected under inverted fluorescence microscope，and the expression of c-Myc mRNA and protein was detected by qRT-PCR and Western blotting.Results The electrophoresis results of Eμ--VH-c-Myc-H2BmRFP gene fragment were in agreement with the predicted value of 4129 bp，and the electrophoresis of the vector DNA showed a band that was consistent with the predicted value of 8561 bp.Enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that pEMIR was successfully constructed.Cells transiently transfected with pEMIR displayed the green and red fluorescence under inverted fluorescence microscope，and the expression of c-Myc was normal.Conclusion The lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter is successfully constructed，and the experiments in vitro demonstrate that it can be expressed in human normal cells and tumor cells.

Eμ-VH promoter；c-Myc oncogen；lentivirus vector；diffuse large B-cell lymphoma

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.001

R394

A

1002-266X（2016）21-0001-03

广东省产业技术研究与开发专项资金资助项目（2013B060300013）。

陈琳（1987-），女，在读硕士，主要研究方向为基因在肿瘤发生发展中的作用及其机制、小型猪肿瘤模型。E-mail：1797342278＠qq.com

（2016-01-14）