幽门螺杆菌阳性患者胃黏膜组织中NOD1受体的表达变化

唐寅思，曹蓉，翁洋，李春丽，温艳惠，周一军

（1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032；2辽宁省肿瘤医院）

幽门螺杆菌阳性患者胃黏膜组织中NOD1受体的表达变化

唐寅思1，曹蓉2，翁洋1，李春丽1，温艳惠1，周一军1

（1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032；2辽宁省肿瘤医院）

目的 观察幽门螺杆菌阳性患者胃黏膜组织中NOD1受体的表达变化。方法 选择病理组织标本120例，其中Hp阳性90例（胃癌组30例、癌前病变组30例、胃炎组30例）、Hp阴性30例（胃炎，对照组），采用免疫组化法检测各组NOD1受体表达，采用RT-PCR法检测各组NOD1受体mRNA表达。结果 与对照组比较，其他三组NOD1阳性表达率、NOD1 mRNA相对表达量均升高（P均＜0.05）；且胃癌组NOD1阳性表达率、NOD1 mRNA相对表达量最高，与其他两组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 幽门螺杆菌阳性患者胃黏膜组织中NOD1受体高表达，且组织病理类型恶性程度越高，NOD1受体表达水平越高。

幽门螺杆菌；核苷酸结合寡聚化结构域样受体；胃肿瘤；胃炎；癌前病变

幽门螺杆菌（Hp）感染已经被证明与多种消化系统疾病相关，如消化道溃疡、胃炎、胃恶性肿瘤、炎症性肠病、食道炎、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、功能性消化不良等，然而其致病机制还未完全阐明，目前得到公认的学说有四种，其中免疫学说越来越受到重视［1］。模式识别受体（PRRs）是通过与病原相关分子模式相结合的方式来识别外源性病原微生物，并将其清除，从而介导天然免疫［2］。近年来关于核苷酸结合寡聚化结构域样（NOD）受体的研究在国内外均有相关报道。NOD1受体广泛表达于成人的组织细胞中，它可以识别细菌的成分（肽聚糖），活化核因子κB（NF-κB），参与固有免疫并诱导炎症反应的发生和细胞凋亡［3］。NOD1受体是否在Hp感染的过程中发挥作用，目前尚不清楚。2014年3月～2015年5月本研究观察Hp感染患者胃黏膜组织中NOD1受体的表达情况，探讨NOD1介导的信号通路在Hp感染中的作用。

1　资料与方法

1.1临床资料 病理组织标本均来源于中国医科大学附属第四医院内镜中心及病理科，共120例，患者男56例、女64例，年龄30～84岁、平均52岁。经快速尿素酶试验及病理检查证实Hp阳性90例，根据病理检查结果分为胃癌组30例、癌前病变组30例、胃炎组30例；Hp阴性30例作为对照组，病理检查结果为胃炎。各组患者性别、年龄比较差异无统计学意义。排除标准：慢性疾病及其他恶性肿瘤（不包括胃癌）患者；妊娠期妇女；甲状腺功能亢进或减退者；饮酒者；应用降脂药、口服避孕药及激素者；4周内使用影响Hp的药物，如抗生素、质子泵抑制剂、氢受体拮抗剂、非甾体抗炎药、铋剂等。

1.2各组NOD1受体表达检测 采用免疫组织化学染色法。病理组织用甲醛固定，石蜡包埋，步骤按试剂盒说明书进行。胞质内出现浅黄色、棕黄色、棕褐色染色提示阳性。采用半定量积分法判断结果［4］：每例切片观察5个高倍镜视野，每视野观察100个细胞，观察阳性细胞占总细胞的百分比和染色程度。阳性细胞百分比＜30%计0分，30%～60%计1分，61%～90%计2分，＞90%计3分；染色程度：未染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；以上两项乘积≥1为NOD1受体阳性表达。

1.3各组NOD1受体mRNA表达检测 采用RTPCR法。用TRIzol提取总RNA，应用Oligo（dT）引物和逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后用RNA酶处理产物。设计特异性引物用于扩增NOD1。其正向引物：5′-AAGCATTTCTGCTACCCGGAG-3′，反向引物：5′-AAGCATTTCTGCTACCCGGAG-3′；GAPDH内参正向引物：5′-ACCTCAGTCAATGGCATCGC-3′，反向引物：5′-TACACCACTCTGGTGCCGTG-3′。通过Light Cycler软件直接获得各样本中NOD1受体mRNA的Ct值，与同样本中内参的Ct值相减，即获得该样本中NOD1受体mRNA的ΔCt值，根据2-ΔΔCt公式计算目的基因相对表达量

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组NOD1阳性表达率比较 胃癌组、癌前病变组、胃炎组、对照组NOD1阳性表达率分别为90%（27／30）、67%（20／30）、53%（16／30）、17%（5／30）；与对照组比较，其他三组NOD1阳性表达率均升高（P均＜0.05）；胃癌组、癌前病变组、胃炎组NOD1阳性表达率比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2各组NOD1 mRNA表达比较 胃癌组、癌前病变组、胃炎组、对照组NOD1 mRNA相对表达量分别为0.64±0.26、0.54±0.27、0.47±0.26、0.28± 0.17；与对照组比较，其他三组NOD1 mRNA相对表达量均升高（P均＜0.05）；胃癌组、癌前病变组、胃炎组NOD1 mRNA相对表达量比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

3　讨论

固有免疫反应是机体抵御外来病原生物入侵的第一道防线。与固有免疫相关的PRRs中，Toll样受体家族主要识别细菌、病毒、真菌和原生动物，而NLRs主要介导抗细菌感染。目前已鉴定出多种不同的炎症复合体，包括NOD。NOD样受体是一类在遗传上高度保守的蛋白质家族，广泛存在于植物、线虫、脊椎动物和人类细胞内，是一种细胞内识别受体［5］。NOD样受体家族中包括5个成员，其中最具代表性的是NOD1和NOD2（分别称为CARD4和CARD15）。NOD1和NOD2可识别细菌细胞壁中的脂多糖和肽聚糖，并依靠其CARD募集受体相互作用蛋白激酶（RIP）家族成员中的受体相互作用蛋白2（RIP2），从而使丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）［6］和NF-κB活化［7］。活化的NF-κB可结合许多蛋白质基因的启动子和增强子部位的κB序列，从而诱导细胞因子、生长因子、急性期蛋白、趋化因子、免疫受体和转录因子等多种物质的表达。相关研究已经表明，NOD1受体与感染、慢性炎症性疾病、肿瘤（包括白血病）、代谢紊乱及自身免疫性疾病相关［8］。

目前关于Hp感染导致消化系统疾病的发病机制有几种学说［1］，即漏顶学说、促胃液素联系学说、基因学说和免疫学说；其中对免疫学说的研究近年来比较广泛，该观点认为作为一种长期定植于人体胃黏膜表面的细菌。Hp可通过多种细菌的黏附、毒力因子对黏膜细胞的直接损伤以及机体对细菌的免疫反应而导致的免疫和（或）炎症组织损伤等机制而引起消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生。Hp感染后，宿主的免疫应答反应在胃黏膜炎症和损害方面也起着一定的作用。局部的细胞免疫和体液免疫反应，激活T细胞、巨噬细胞和补体反应，使中性粒细胞和单核细胞释放IL-2、IL-6以及激活氧自由基和一氧化氮的释放，导致炎症和细胞损伤。现已有研究证实，NOD1参与介导Hp感染性胃病，从不同层面证实了两者具有相关性。其中Wang等［9］研究认为，在中国汉族人群中，NOD1基因多态性与胃癌发病相关。Kim等［10］研究认为，NOD1（796G＞A）单核苷酸改变与韩国地区Hp相关性胃病发病有相关性；Oikawa等［11］研究认为，日本人中NOD1基因多态性与糜烂性食管炎发病有相关性。基于细胞水平的研究证明，NOD1信号通路在Hp感染中得以激活，从而介导了其相关疾病的发病及进展［12］；除此之外，以动物（小鼠）为研究对象的一些国内外报道也证实了上述观点，通过Hp感染小鼠模型，验证NOD1与Hp感染相关胃病的发病具有相关性［13］；且已有许多下游的细胞因子（如IL-18、IL-33等）被证实通过调控NOD1信号通路影响其表达水平。但通过人组织病理为实验材料的相关实验的研究相对较少。

本研究在RT-PCR和免疫组化两项实验中均得到相同提示：对照组与胃炎组中mRNA表达及NOD1受体的表达均存在差异，且其差异有统计学意义，表明NOD1受体可能参与介导了Hp感染相关疾病。胃癌组、癌前病变组、胃炎组之间NOD1 mRNA表达及NOD1受体的表达均存在统计学差异，表明组织病理恶性程度不同，NOD1受体表达情况也不相同。提示Hp感染后的胃炎、癌前病变及胃癌的胃黏膜组织中，在不同病理阶段其表达程度存在差异，即NOD1受体介导的信号传导通路对胃黏膜造成损伤在不同病理阶段产生不同程度的作用。

本研究结果说明，NOD1受体的表达与Hp感染情况相关，即NOD1信号通路在Hp感染中得以激活。NOD1受体及其信号转导过程和表达在Hp相关胃病中的研究有助于完善对Hp感染发病机制的探索，可能为Hp感染相关胃病的治疗提供新的靶点，有希望为疫苗研制提供可行性思路；NOD1受体阳性表达对胃癌癌前病变黏膜组织的动态监测可能成为胃癌诊治的新方向。未来随着更多的PRRs的发现及其识别机制的阐明，将促进更多的新型药物问世，从而为人类战胜更多疾病提供强有力武器。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.032

R573

B

1002-266X（2016）21-0079-03

周一军（E-mail：zhoudoctor＠163.com）

（2015-08-27）