冠状动脉慢血流患者血清microRNA-21表达及意义

王磊，杨幼生，詹羽，任飞，谢翠，武文艺

(1湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000；2安陆市普爱医院)

冠状动脉慢血流患者血清microRNA-21表达及意义

王磊1，杨幼生2，詹羽1，任飞1，谢翠1，武文艺1

(1湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000；2安陆市普爱医院)

目的 检测冠状动脉慢血流患者血清microRNA-21(miRNA-21)表达情况，探讨其意义。方法 选择冠状动脉造影检查诊断为冠状动脉慢血流患者42例(慢血流组)、冠状动脉血流正常者46例(对照组)，二者校正的心肌梗死溶栓试验(TIMI)血流帧数分别为(31.47±2.86)、(20.71±1.96)帧。采用荧光定量PCR法检测两组血清miRNA-21相对表达量，分析慢血流组血清miRNA-21相对表达量与TIMI血流帧数的关系，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miRNA-21相对表达量对冠状动脉慢血流的诊断价值。结果 慢血流组及对照组血清miRNA-21相对表达量分别为3.83±1.03、2.01±0.54，两组比较P<0.01。慢血流组TIMI血流帧数与miR-21表达呈正相关(r=0.646，P<0.01)。miRNA-21诊断冠状动脉慢血流的ROC曲线下面积(AUC)为0.886(95%CI:0.819～0.953)，特异性为82.61%、敏感性为78.57%。结论 冠状动脉慢血流患者血清miRNA-21相对表达量增加，血清miRNA-21可作为早期诊断冠状动脉慢血流的指标。

冠状动脉慢血流；microRNA-21；冠状动脉造影；校正的心肌梗死溶栓试验

冠状动脉(简称冠脉)慢血流指除外严重的冠脉狭窄、痉挛、气体栓塞、溶栓治疗后、冠脉成形术后、冠脉扩张、心肌病、瓣膜病、结缔组织病等因素，冠脉造影显示管腔无明显狭窄，但对比剂到达血管远端的时间明显延迟的现象[1]。冠脉慢血流患者常表现为胸痛反复发作，也可伴有心肌梗死、室性心动过速、室颤等[2]。但至今其确切发病机制仍未完全明确，且常规的冠脉造影不易发现早期血管壁病变。研究表明，microRNA-21(miRNA-21)在心脏组织和细胞中高表达，并与急性心肌梗死、心肌细胞凋亡、动脉粥样硬化、心房纤维化等密切相关[3～6]。本研究检测冠脉慢血流患者血清miRNA-21表达情况，探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1～10月在十堰市人民医院经桡动脉路径行冠脉造影检查患者968例，采用校正的心肌梗死溶栓试验(TIMI)血流记帧法(cTFC)定量检测冠脉血流[7]。最终明确诊断冠脉慢血流42例(慢血流组)，男26例、女18例，年龄(59.7±7.5)岁，BMI 24.8±4.6，HR(70.7±5.9)次/min，高血压17例、糖尿病16例、血脂紊乱22例，吸烟11例。同期选择冠脉血流正常者46例(对照组)，男24例、女22例，年龄(61.2±9.2)岁，BMI 25.3±3.3，HR(69.7±6.8)次/min，高血压16例、糖尿病20例、血脂紊乱24例。两组性别、年龄、BMI、伴发病等基本资料具有可比性。观察组TIMI血流帧数为(31.47±2.86)帧，其中矫正后的前降支为(27.45±2.08)帧、回旋支为(33.21±3.54)帧、右冠脉为(31.64±3.38)帧；对照组TIMI血流帧数为(20.71±1.96)帧，其中矫正后的前降支为(19.78±1.36)帧、回旋支为(20.58±2.76)帧、右冠脉为(21.37±2.97)帧；两组比较P均<0.05。排除有心肌梗死病史、冠脉介入手术史者，心肌病、瓣膜病、高血压心脏病、先天性心脏病患者，左心室射血分数>55%者，冠脉狭窄或扩张、冠脉痉挛及肝、肾功能异常者。

1.2 血清miRNA-21表达检测 采用Real-time PCR法。两组均于冠脉造影明确诊断后清晨空腹条件下采用EDTA管抽取外周全血5 mL，室温下静置30 min，4 ℃下1 200 g离心15 min，将上层血清吸出移至1.5 mL EP管。所有血清样本冰上放置，每个样本取250 μL转移至含有750 μL血清的RNA提取试剂TRI Reagent BD的新EP管中。依照TRI Reagent BD提供的方案提取RNA，RNA质量通过分光光度计检测并定量。每个获得的RNA沉淀重新悬浮于20 μL DEPC水，置于-80 ℃冰箱。每个待测样本取500 ng总RNA，利用逆转录试剂盒(TaKaRa，中国大连)合成互补DNA(cDNA)，稀释4倍后取2 μL作为PCR模板。利用ABI 7500 Real-time PCR仪检测miRNA-21表达水平，反应体系和程序设置均参考试剂盒说明书。内参基因U6和目的基因miRNA-21的逆转录引物和PCR引物均购自广州市锐博生物科技有限公司。采用2-ΔΔCT法计算miRNA-21相对表达量。Ct数值为实时荧光反应强度达到设定阈值时的扩增循环数，ΔCt=CtmiRNA-21-CtU6；ΔΔCt=ΔCt慢血流组-ΔCt对照组。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，分析血清miRNA-21相对表达量对冠状动脉慢血流的诊断价值。

2 结果

慢血流组血清miRNA-21相对表达量为3.83±1.03，对照组为2.01±0.54，两组比较P<0.01。慢血流组TIMI血流帧数与miRNA-21表达呈正相关(r=0.646，P<0.01)。以miRNA-21作为生物学指标诊断冠脉慢血流的ROC曲线下面积(AUC)为0.886(95%CI:0.819～0.953)，以miRNA-21相对表达量为2.515为截点，其诊断特异性为82.61%、敏感性为78.57%。

3 讨论

自1972年Tambe等首次报道冠脉慢血流以来，国内外对其发病机制的研究逐渐增多，但其确切发生机制尚未明确。目前认为，其发生与微血管病变、内皮功能障碍、冠脉粥样硬化、血小板形态和功能异常、炎症反应、氧化应激、血管炎等有关，并普遍认为内皮功能障碍、冠脉粥样硬化及其导致的微循环病变在冠脉慢血流的发生中起重要作用[9]。内皮受损是动脉粥样硬化发生的启动因素，可使动脉粥样硬化脂质沉积物集中在血管壁，导致血管外弹力膜扩张，形成离心性病变，但血管有效腔并未减小，故冠脉造影不能发现血管腔狭窄，尽管此时血管已有病变。因此，常规的冠脉造影不易发现冠脉慢血流患者早期血管壁病变。Cin等[10]研究发现，冠脉慢血流患者冠脉造影时未见明显狭窄或不规则，但血管内超声显示冠脉平均内膜-中膜厚度、内膜-中膜面积均显著增高，心外膜冠脉存在弥漫性或局限性钙化。但血管内超声设备昂贵、操作复杂，在临床上推广应用困难大。

miRNA是内源性的非编码小RNA，由22～23个核糖核苷酸组成，负向调控转录后基因表达，约60%的人类基因受miRNA调控[11]。miRNA存在于多种体液中，包括血浆与血清，细胞外循环miRNA可以多种不同形式存在，如微囊泡、外来体、凋亡小体等。miRNA可与一些蛋白质结合形成复合物，如Ago2、核仁磷酸蛋白、LDL、HDL，使miRNA具有稳定性好、不易降解的特性[12]。Chen等[13]报道，miRNA-17-5p诊断冠心病具有较好的敏感性和特异性，miRNA-17-5p可能在冠脉粥样硬化的发生、发展中扮演关键角色。Cengiz等[14]发现，颈动脉内膜-中膜厚度(CIMT)增加的高血压患者血清miRNA-21水平较正常对照者升高近4倍。CIMT是早期动脉粥样硬化病变的标志，与心脑血管事件的发生密切相关。进一步研究发现，miRNA-21参与内皮细胞中NO通路激活。Sabatel等[15]研究发现，血流剪切力的增加会诱导miRNA-21表达，且在肺动脉高压的血管中检测到miRNA-21高表达。内皮间质转化是内皮细胞转化为成纤维细胞的重要表型改变。miRNA-21表达增加亦可导致内皮间质转化。Kumarswamy等[16]研究发现，小鼠左心室压力超负荷亦会增加miRNA-21表达，而miRNA-21拮抗剂则可阻断上述效应。本研究结果显示，慢血流患者血清miRNA-21相对表达量较对照组明显升高，提示miRNA-21在慢血流的发生、发展过程中可能具有一定作用。本研究进一步分析显示，慢血流组TIMI血流帧数与miRNA-21表达呈正相关；以miRNA-21相对表达量为2.515为截点，其诊断慢血流的特异性为82.61%、敏感性为78.57%；因此，初步推测miRNA-21可以作为诊断慢血流患者的生物学指标。

总之，冠脉慢血流患者血清miRNA-21相对表达量增加，miRNA-21表达变化可能参与了冠脉慢血流的发生；血清miRNA-21可作为早期诊断冠状动脉慢血流的指标。

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湖北省教育厅科学技术研究项目(Q20152104)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.024

R541.4

B

1002-266X(2016)28-0068-03

2015-11-20)