p53基因第7、8外显子突变与广西肝癌家族聚集遗传易感性的关系

于冰雪，吴健林，吴继周，龚婷婷，王尊付，钟彬

(1广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2广西医科大学第六附属医院)



p53基因第7、8外显子突变与广西肝癌家族聚集遗传易感性的关系

于冰雪1，吴健林1，吴继周1，龚婷婷1，王尊付2，钟彬1

(1广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2广西医科大学第六附属医院)

目的 探讨p53基因第7、8外显子突变(exon7/exon8)与广西肝癌高发区肝癌家族聚集遗传易感性的关系。方法 依配对方法选择广西肝癌高发区肝癌高发家族、肝癌单发家族和无癌家族中未发生肝癌的家族成员各123例为家族组，同时选择广西肝癌高发区内30例肝癌患者作为肝癌组。控制HBV、HCV感染及环境因素后，应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析结合基因测序的方法筛查p53基因exon7/exon8突变情况。结果 肝癌组p53基因exon7/exon8总突变率为13.3%(4/30)，家族组exon7/exon8总突变率为0，P<0.05。结果 p53基因exon7/exon8突变可能不是广西肝癌高发区肝癌家族聚集的遗传易感因素。

原发性肝癌；家族聚集性；p53基因；基因突变；聚合酶链式反应-单链构象多态性分析；广西

广西是我国肝癌高发区之一，具有明显的肝癌家族聚集现象[1]。肝癌家族聚集现象的本质被认为是遗传基因改变因素与肝癌发生之间存在密切相关性[2,3]，主要与原癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。p53基因被认为是人类肿瘤中最常发生突变的抑癌基因，第7、8外显子(exon7/exon8)突变作为肝癌中p53基因突变热点的一部分[4]，与广西肝癌家族聚集现象之间有何种联系？是否会发生在广西肝癌家庭成员中？广西肝癌家庭成员是本身就携带p53基因exon7/exon8遗传突变体，还是在环境等因素影响下发生的，尚无此方面的研究报道。2014年3月～2015年1月，我们应用聚合酶链式反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)分析结合基因测序的方法初步观察广西肝癌高发区人群p53基因exon7/exon8突变情况，以了解其与广西肝癌高发区肝癌家族聚集遗传易感性的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择广西肝癌高发区的都安、大化、武鸣、横县等10个县(区)，涉及27个肝癌高发家族、25个肝癌单发家族和31个无癌家族，依配对方法选择性别、年龄、民族、生活环境、生活习惯、HBV感染、肝功能具有可比性的肝癌高发家族、肝癌单发家族和无癌家族中未发生肝癌的家族成员各123例作为家族组，共369例。其中，男234例、女135例，年龄(29.44±16.72)岁；HBV感染90例，HCV感染0例。肝癌高发家族成员：直系亲属中发生过2例及以上肝癌的家族成员；肝癌单发家庭成员：直系亲属中发生过1例肝癌的家庭成员；无癌家族成员：直系亲属中未发生过任何恶性肿瘤病例的家族成员。选择广西肝癌高发区内30例肝癌患者作为肝癌组，均符合第八届全国肝癌学术会议修订的诊断标准[5]。其中男22例，女8例，年龄(41.37±11.14)岁；HBV感染11例，HCV感染0例。两组HBV、HCV感染情况具有可比性(P均>0.05)。

1.2 p53基因exon7/exon8突变筛查方法

1.2.1 标本采集 采集每位研究对象空腹外周血，分装于无菌离心管内，-80 ℃保存备用。

1.2.2 基因组DNA提取 用人全血基因组DNA提取试剂盒提取，提取后用超微量核酸蛋白分析仪(NanoDrop 2000)直接检测DNA的浓度和纯度，调节DNA浓度至80～100 ng/μL，A260/A280值1.6～1.8，合格样品保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3 p53基因exon7/exon8的PCR扩增 根据参考文献[6]设计p53基因exon7/exon8特异性序列引物各1对，由上海生工生物工程有限公司合成。Exon7上游引物5′-TAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3′，下游引物5′-TGACCTGGAGTCTTCCAGTGT-3′，序列长度117 bp；Exon8上游引物5′-AGTGGTAATCTACTGGGACGG-3′，下游引物5′-ACCTCGCTTAGTGCTCCCTG-3′，序列长度141 bp。PCR扩增均采用25 μL反应体系，包括PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去RNA酶水9.5 μL，DNA模板1 μL。PCR扩增条件:exon7为预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35个循环，末次延伸72 ℃ 10 min。exon8为预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35个循环，末次延伸72 ℃ 10 min。取PCR产物5 μL在2%的琼脂糖凝胶上电泳(110 V，30 min)，所有研究对象可扩增出目的基因。

1.2.4 SSCP分析 制备12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加入l×TBE缓冲液(4 ℃)，预电泳30 min备用。取 PCR产物、甲酰胺上样缓冲液各8 μL，混匀，96 ℃变性10 min，立即冰浴5 min；按序加样，50 bp DNA ladder marker及未变性PCR产物5 μL作对照。2 00 V电泳180～200 min，至二甲苯青移至凝胶底部时停止。取下凝胶，进行银染色，10%乙醇10 min，1%硝酸10 min，0.1%硝酸银10 min，12.5%碳酸钠溶液(含甲醛1 mL/500 mL)中显影，至出现清晰条带；1%乙酸溶液终止显色，拍照存档。

1.2.5 结果判定 各样本间相互比较，单链条带位置存在泳动差异或数量增多时判定为突变阳性样本[7]。

1.2.6 基因测序 SSCP阳性标本的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，并将测序结果与从NCBI Gene数据库中下载的p53基因exon7/exon8标准序列进行比较。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料以率表示，组间比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肝癌组经PCR-SSCP分析结合基因测序确定3例p53基因exon7突变和1例p53基因exon8突变，突变率为13.3%(4/30)。家族组肝癌高发家族、肝癌单发家族和无癌家族中均未发现p53基因exon7/exon8突变，突变率为0。肝癌组与家族组肝癌高发家族、肝癌单发家族及无癌家族p53基因exon7/exon8突变率差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

广西是我国肝癌高发区之一，并具有明显的肝癌家族聚集现象，其主要危险因素被认为是HBV感染,特别是HBV的复制、饮用塘水和遗传因素三者共同作用[24]；其中，遗传因素在肝癌发生中的作用越来越受到重视。p53基因是一种抑癌基因，是目前发现与人类肿瘤相关性最高的基因。抑癌基因p53突变参与多种恶性肿瘤的发生和发展,包括肝癌在内大约50%以上的人类恶性肿瘤中出现p53基因突变[8]。本研究在广西肝癌高发区30例肝癌患者中检测到p53基因exon7/exon8突变，那么在广西肝癌家庭成员中是否也存在此类突变，是其本身就携带p53基因exon7/exon8遗传突变体，还是在环境等因素影响下发生的，国内外尚无此方面的研究报道。

本研究将HBV、HCV感染作为混杂因素控制后，检测广西肝癌高发区内肝癌高发家族、无癌家族、肝癌单发家族中尚未发生肝癌的成员中p53基因exon7/exon8，均未发现突变。p53基因exon7/exon8突变可能不是广西肝癌高发区肝癌家族聚集的遗传易感因素。

在我国肝癌高发区，HBV慢性感染常与黄曲霉毒素B1(AFB1)暴露同时存在。两者在肝癌的发病中与抑癌基因p53均有一定的联系[9,10]。有研究表明，与非乙肝相关性肝癌相比，乙肝相关性肝癌患者中更易检测出p53基因突变[11]。HBV慢性感染与AFB1长期暴露的协同效应可能更易引起肝癌患者p53基因突变。Pineau等[12]研究发现，AFB1低暴露的意大利及法国肝癌患者中p53基因突变检出率较低，分别为25%、18%，而AFB1高暴露的上海肝癌患者p53基因突变的检出率达48%，认为AFB1暴露与p53基因突变有一定相关性。肝癌中p53基因突变频率没有年龄、性别差异，但HBV-DNA阳性以及AFB1-DNA加合物阳性者p53基因突变频率高于HBV-DNA以及AFB1-DNA加合物阴性者[13]，AFB1暴露与HBV感染同时存在的情况下，其协同作用可能引起肝癌中p53 基因突变率更高[14]。此外，p53基因突变更可能发生在肝癌晚期[15]。由此，与肝癌患者的HBV感染情况、AFB1暴露情况以及病情进展情况等因素有关，这些因素在肝癌的发病机制中均起到一定作用。本研究在肝癌患者中检测到p53基因exon7/exon8突变率为13.3%，肝癌家庭成员中p53基因exon7/exon8突变率为0。推测广西肝癌高发区肝癌家庭成员可能尚未发生p53基因exon7/exon8突变或较为罕见，突变可能为后天在多种因素的影响下发生，并参与肝癌的发生与发展。

流行病学研究表明，遗传因素在肝癌的发病中是存在的，但肝癌不符合单基因遗传模式，是一种多基因、多因素、多阶段的疾病,受遗传与环境的综合影响[16]。在广西肝癌高发区，p53基因exon7/exon8突变可能不是肝癌家族聚集的遗传易感因素，是否会在后天多种因素的影响下发生而参与肝癌的发生与发展，尚需进一步研究。

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Correlations between p53 gene mutations in exon 7/8 and genetic susceptibility to familial aggregation of hepatocellular carcinoma in high incidence area of Guangxi

YUBingxue1,WUJianlin,WUJizhou,GONGTingting,WANGZunfu,ZHONGBin

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the relationship between the mutations of exon 7/exon8 of p53 gene and genetic susceptibility to familial aggregation of hepatocellular carcinoma in high incidence area of Guangxi.Methods We selected patients from families who had two or more HCC, families who had only one HCC, and families who had no HCC so far. Each family had 123 cases, and all the families were selected from the high incidence of HCC areas of Guangxi. They were taken as the family groups. Meanwhile, another 30 cases of HCC patients were collected from high incidence of hepatocellular carcinoma as the HCC group. HBV infections, HCV infections and environmental factors were controlled as confounding factors. Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) was used to screen the mutations of exon 7/exon 8 of p53 gene. Results The total mutation rate of exon 7/exon 8 of p53 gene in the HCC group was 13.3% (4/30). The mutation rate of exon 7/exon 8 of p53 gene in the three family groups was 0. There was significant difference between the family groups and the HCC group(P<0.05).Conclusion p53 gene mutations in exon 7/exon 8 may not be the genetic susceptibility factors for familial aggregation of hepatocellular carcinoma in high incidence area of Guangxi.

primary hepatocellular carcinoma; familial Aggregation; p53 gene mutations; polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism analysis; Guanxi

广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019181)。

于冰雪(1989-)，女，硕士，住院医师，主要研究方向为肝脏病的发病机制和诊疗。E-mail: bingxue1031@163.com

简介：吴健林(1970-)，男，博士，主任医师，主要研究方向为病毒性肝炎的基础与临床。E-mail: wjl4954@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.007

R735.7

A

1002-266X(2016)38-0023-03

2016-06-11)