中药砷剂活性代谢产物单甲基亚砷酸的生物学效应研究进展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

邹建华1，付　娟1，陈　喆2（1.浙江中医药大学，浙江杭州310053；2.浙江省中医院，浙江杭州310006）



中药砷剂活性代谢产物单甲基亚砷酸的生物学效应研究进展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

邹建华1，付娟1，陈喆2
（1.浙江中医药大学，浙江杭州310053；2.浙江省中医院，浙江杭州310006）

关键词三氧化二砷；单甲基亚砷酸；生物学效应；研究进展

三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）俗称砒霜，始载于宋《开宝本草》，其味苦酸，有毒，归脾、肺、肝经，具有蚀疮、去腐、杀虫、劫痰定喘、劫疟之功。砷是一种广泛存在于人类生活环境中的致癌物质［1］，与包括皮肤癌、肺癌和膀胱癌在内的多种恶性肿瘤相关。近年来，As2O3被成功应用于治疗急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）［2］。此外，砷可以诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡。单甲基亚砷酸（MMAIII）是As2O3甲基化的活性代谢产物，大量研究表明MMAIII具有比As2O3更强的生物学活性［3-4］。低剂量短期作用表现明显的抗肿瘤作用，长期慢性暴露在MMAIII下导致细胞恶性转化。现通过检索国内外相关文献，综述As2O3代谢产物MMAIII的急性和慢性生物学效应。

1三氧化二砷体内代谢过程

砷是一种广泛存在于人类生活环境中的致癌物质。近年研究发现As2O3在体内代谢有两个关键过程：①五价砷被还原。五价砷被还原为三价状态，主要通过砷酸盐还原酶催化的酶促反应和谷胱甘肽催化的非酶促反应两种途径完成。②三价砷的甲基化。被还原为三价状态的砷在肝脏甲基转移酶的催化下生成单甲基砷酸（MMAV），在MMAV还原酶的作用下MMAV被还原为单甲基亚砷酸（MMAIII），MMAIII可以进一步被甲基化为二甲基亚砷酸（DMAIII）。在上述过程中，谷胱甘肽（GSH）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）发挥了重要的作用［5-6］。

2 MMAIII的急性生物学效应

2.1 MMAIII诱导内质网应激介导的肿瘤细胞凋亡

内质网应激（ERS）在细胞凋亡、生存、增殖和分化中发挥了重要的调控作用［7］。PERK是内质网上的一种跨膜蛋白，当ERS发生时PERK自身磷酸化为PPERK而被激活，进而通过级联反应激活转录因子4 （activating transcription factor-4，ATF4）及下游重要的凋亡启动蛋白CHOP的表达，诱导细胞凋亡［8-9］。有研究发现15 μM隐丹参酮（CPT）分别联合1 μM MMAIII和1 μM As2O3协同作用乳腺癌MCF-7细胞，24 h后MTT法检测发现MMAIII联合CPT协同抗乳腺癌MCF-7细胞效果明显优于As2O3联合CPT。Western blot检测MMAIII联合CPT协同作用1 h后P-PERK蛋白表达显著增高，并且呈时间依赖性促进下游蛋白ATF4及CHOP的表达，进而诱导促凋亡蛋白Bax、Bak的活化和细胞色素C的释放，引起MCF-7细胞凋亡［10］。

2.2 MMAIII通过泛素化蛋白酶系统诱导P53蛋白降解引起细胞凋亡

P53是一种重要的抑癌基因，其编码产物参与细胞周期调控［11-12］。大量研究表明，被泛素化的P53蛋白最终在细胞质内通过Mdm2泛素化蛋白酶系统降解，进而发挥对细胞周期的调控作用［12-16］。槲皮素联合MMAIII作用正常角质HaCaT细胞后通过诱导P53蛋白泛素化促进HaCaT细胞凋亡发生［17］。

2.3 MMAIII通过抑制线粒体功能诱导细胞凋亡

大量文献报道线粒体在凋亡的早期即出现结构与功能的变化，包括通透性转运孔（permeability transition pore，PTP）的开放和跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential，MTP）的耗散。另有研究表明MMAIII影响线粒体通透性转换孔的功能促进线粒体内膜的Ca2+内流，引起线粒体肿胀、细胞色素C释放，诱导细胞凋亡发生［18］。已有研究报道，MMAIII抑制大鼠肝脏RLC16细胞线粒体呼吸链复合物II和IV的活性，诱导活性氧（ROS）的产生，促进细胞凋亡［19］。

2.4 MMAIII增强血管收缩引起血压升高

高血压与中风、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等疾病的发生发展密切相关，大量流行病学证据表明，砷暴露与高血压在内的多种心血管系统疾病密切相关。Lim K M等［20］将新鲜分离的大鼠主动脉环暴露于MMAIII（＜0.5 μM）发现可以增强激动剂诱导的血管收缩和升压反应，Western blot检测发现MMAIII呈时间和浓度依赖性促进苯肾上腺素（phenylephrine，PE）对RhoA的活化，进而说明MMAIII增强血管收缩引起高血压与RhoA的激活密切相关。

2.5 MMAIII诱导血小板凋亡，促进血栓形成

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露在细胞外膜是激活凝血的重要过程，也被认为是细胞凋亡的标记之一［21］。Bae O N等［22］利用50 μM MMAIII作用人血小板1 h后发现PS外翻增加，线粒体膜电位改变，凋亡蛋白表达增多。上述过程中PS外翻与蛋白质的巯基和细胞内ATP水平下降有关，加入NAC和L-半胱氨酸等巯基化合物后可以明显逆转上述反应。这意味着蛋白质的巯基和ATP的耗竭可能有助于MMAIII诱导PS外翻，诱导血小板凋亡，促进血栓形成。

2.6 MMAIII抑制T细胞的增殖影响免疫系统的功能

体内外实验研究证明,环境中的亚砷酸盐会影响免疫功能，砷通过饮用水暴露在人群中，对人体T细胞免疫功能产生影响，而免疫抑制与感染、癌症和其他疾病的发生发展密切相关。Burchiel S W等［23］将30个正常捐赠者血液中的T细胞暴露于1 nM～100 nM的MMAIII和NaAsO254 h后发现100 nM的NaAsO2对大多数捐赠者的T细胞没有明显的增殖抑制作用，但是100 nM MMAIII能明显抑制所有捐赠者T细胞的增殖，进而影响捐赠者的免疫功能。

2.7 MMAIII急性暴露后抑制胆固醇的合成

胆固醇是人类细胞膜的重要组成部分，胆固醇合成不足可以影响细胞膜的稳定性。Guo L等［24］利用定量蛋白质组学检测MMAIII作用人类皮肤成纤维细胞GM00637后蛋白组学的变化情况，发现MMAIII可以下调胆固醇合成酶，使内源性胆固醇的合成减少。

3 MMAIII的慢性生物学效应

3.1 MMAIII长期暴露活化COX-2，促进膀胱细胞恶性转变

COX-2是负责类花生酸合成的诱导酶，在促进细胞增殖、抑制细胞死亡、诱导血管生成和促进转移侵袭中发挥调控［25-26］。Src、PI3K、COX-1、COX-2信号通路与MMAIII诱导的UROtsa细胞非贴壁性生长密切相关。提示COX-2或COX-2介导的信号转导通路在MMAIII诱导膀胱上皮细胞恶性转化中发挥重要作用。

3.2 MMAIII长期暴露促进炎症相关因子释放，引起炎症反应

炎症反应常被认为是一种对机体有害的生物学现象［27］，Virchow最初观察到被特定化学刺激物引发的组织炎症与细胞增生程度增强有关，提出慢性炎症与癌变之间存在关联［28］。细胞坏死时细胞膜破裂，细胞质释放到邻近细胞引起炎症反应。大量文献表明，MMAIII可以促进多种炎症因子的释放，进而激活细胞内多种信号通路，促进肿瘤的发生发展。有研究报道50 nM MMAIII作用于UROtsa细胞3个月后可以刺激TNFα、IL-6、IL-8等炎症因子的释放，引起炎症反应［29］。UROtsa细胞长期暴露在MMAIII中发现炎症相关因子（IL-1β，IL-6 and IL-8）分泌增多，其中IL-8尤为明显。IL-8可以进一步激活NFKβ、AP1/cjun、ERK2、STAT3等炎症相关基因表达上调，基因沉默IL-8后可以逆转该现象［30］。上述结果表明IL-8介导了MMAIII促进UROtsa细胞恶性转化。

3.3 MMAIII长期暴露后影响DNA修复功能

细胞的恶性变与DNA的损伤有着密切的关系，DNA损伤修复有多种酶参与，PARP-1是参与DNA碱基切除修复启动的关键酶。Wnek S M等［31］发现MMAIII连续处理UROtsa细胞8 w、12 w后可显著增加DNA单链的断裂，断裂的DNA可以迅速激活PARP-1，PARP-1的修复作用主要依赖于其N末端与DNA结合区域的两个锌指结构。MMAIII可以竞争性与两个锌指结构结合，从而抑制PARP-1蛋白功能，引起DNA损伤，促进UROtsa细胞恶性转化。

4问题与展望

目前，小分子药物靶点的发现对于生物和医学具有重大意义，研究小分子化合物与蛋白质分子间的相互作用已成为热点。MMAIII作为As2O3的小分子甲基化代谢产物，具有比As2O3更强的生物学效应，但其分子学作用机制仍不明确。大量体外实验表明MMAIII抗肿瘤效果明显优于As2O3，且其毒副反应更小。尽管As2O3成功用于临床治疗APL等多种恶性肿瘤，但MMAIII的临床应用文献报道甚少。阐明MMAIII分子作用机制为中药砷剂的深入研究，指导临床治疗用药是我们目前亟待解决的问题。随着对中药砷剂研究的不断深入，人们对其活性代谢产物MMAIII的认识不断加深，这为其临床应用和新药开发提供了理论依据，MMAIII具有广阔的临床应用前景。

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（编辑：张世霞）

中图分类号：R282.76

文献标识码：A

文章编号：1671-0258（2016）02-0073-03

［基金项目］国家自然科学基金（81473389）

［作者简介］邹建华，在读硕士，E-mail：2836088573@qq.com

［通讯作者］陈喆，副研究员，研究生导师，E-mail：alexisczh@sohu.com