浅谈微生物浊度法在测定硫酸链霉素中的影响因素
2016-04-05赵化芳
赵化芳
(新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐 830063)
浅谈微生物浊度法在测定硫酸链霉素中的影响因素
赵化芳
(新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐 830063)
浊度法是在比色皿中按拉丁方排列，加入高低含量的标准品和样品溶液1ml，再加入含葡萄球菌的液体培养基9ml，通过测定标准品和硫酸链霉素的吸光度，计算样品含量。现将试验过程中的环境、仪器设备、菌种、培养基、缓冲液、抗生素配置和参数设置等影响因素浅谈如下。
浊度法；硫酸链霉素；影响因素
1 环境和仪器设备的影响
半无菌室环境，室内照明充足，最好有温度控制设备，并安装紫外线消毒灯，操作台高低要合适。WBS-100微生物比浊法测定仪配备传热均匀的专用试管，减少因试管壁传热不均造成的光路长度不均的影响；具有升温快速均匀，温度精密度高，入射光波长精度高，振摇培养，在线实时检测等功能。实验环境和仪器设备是保障试验成功的前提条件。
2 菌种选择和菌浓度的影响
2.1 菌种的选择
实验用菌种应保持新鲜、纯净，对抗生素反应应灵敏。若菌种不新鲜，其生长速度慢，在规定时间内浊度达不到要求；若菌种不纯，各管形成的吸收度精密度差，可信限率高；若菌种对抗生素反应不灵敏，高低剂量抗生素形成的吸收度距离减小，测定结果可信限率显著增高。本实验选用对链霉素反应灵敏的金黄色葡萄球菌的第三代培养菌，接种到营养琼脂斜面培养基上，37℃培养24h，用7ml灭菌水将菌苔洗下制成菌悬液，当天使用。
2.2 菌浓度的要求
菌液浓度过高会使浓度-光吸收度不成直线关系，如果菌液浓度过稀，则读数偏低，误差增大，在实际测定时一般可控制吸收度读数在0.3～0.7A较为适宜[1]。
3 培养基pH值和性质的影响
采用液体培养基，无扩散因素的影响，实验的灵敏度高，结果的精密度和正确率高。硫酸链霉素属于碱性抗生素，抗生素检定培养基3号，pH为7.0～7.2，含有牛肉膏、酵母提取物，葡萄糖和磷酸盐等促进细菌快速生长的条件。称取抗生素检定培养基3号19.0g加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸完全溶解后分装，116℃高压灭菌30min，灭菌时间不宜过长，灭菌后不得发生沉淀，影响培养基性能。
4 缓冲液的影响
称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水定容至1000ml容量瓶，配制pH值为7.8的缓冲液[1]。分装于硬质玻璃容器内，应澄明无色，必要时用耐酸过滤漏斗滤除沉淀，121℃高压灭菌30min后不得有沉淀，影响透光度。
5 抗生素溶液配置和加入的影响
分别精密称取链霉素标准和注射用硫酸链霉素适量于容量瓶中，加入适量灭菌水使标准品和样品溶解完全，定容制成含1000U/ml的溶液；根据试验菌的灵敏度选择溶液的剂间比为1：1.5，剂间比过大将导致高低剂量间浊度值距离过大，剂间比过小则相反；根据抗生素浓度浓度范围，加入pH7.8灭菌缓冲液配置标准品和样品溶液的最终浓度为6 U/ml和9 U/ml。抗生素浓度过高过低均不能得到正确的实验结果。
按拉丁方排列加入上述溶液，以抵消培养箱内温度的差异所引入的误差。分别在某一标记处沿壁将高低浓度的标准品和样品溶液各1ml加入到比色皿中，在标记稍上处沿壁加入含菌培养基9ml，将沾在壁上的抗生素充分洗入培养基内，减少浓度误差。同时制备含菌阳性对照管和无菌培养基空白对照管。整个过程在短时间内完成，减少抗生素与含菌培养基接触时间不同造成的误差。
6 培养条件设置的影响
将加入试剂的石英比色皿放入WBS-100微生物比浊法测定仪中，根据实验要求设置实验参数：培养温度为37℃，振摇间隔时间为5min，单次振摇时间为20s，振摇频率为2HZ，监测间隔时间为10min，监测开始时间为45min停止时间为240min。
培养基的顶端部分为微亲氧性，底部为厌氧性，采用间隔一段时间振摇一次的方法，增加氧的供应，促进生长，缩短培养时间，但设置合理的振幅和振摇频率，避免振摇过程中产生气泡干扰试验结果；实时监控生长情况，智能判断培养终止时间，在线快速读数，有效减小了因测量时间先后导致的浊度值差异。
经统计，通过浊度法测定效价平行性好，精密度高、可信限率低至3以下，偏离平行符合规定，满足实验需要。
7 防止污染
实验过程中严防抗生素、微生物、灰尘和毛发等污染，试验用比色皿、吸管等应用硫酸-重铬酸钾浸泡12h以上，再用蒸馏水和去离子水冲洗干净，经高压灭菌后使用，严防抗生素残留和微生物污染。另外在培养基、缓冲液，抗生素配置过程中严防空气中灰尘和自制棉赛毛发污染，影响澄明度和浊度值。
8 小结
浊度法具有灵敏度高，精密度高，测量结果准确、可信限率低、时间短等优点，3～4h内完成监测，当天获得试验结果。但浊度法要求高，消除环境设施、仪器设备、试剂材料和参数设置等不利影响因素，防止抗生素、微生物和灰尘毛发等污染。
[1] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S].北京：中国农业出版社，2010：附录，121-128.
[2] 彭素梅，李洪波.浊度法测定四环素效价的可行性研究[J].中国现代药物应用，2010，4（14）：131-132.
[3] 丁勃，杨娜，谢元超.比浊法测定抗生素效价中常见问题及分析[J].中国药品标准，2010，11（6）：438-440.
赵化芳（1987—），女，大学本科，助理兽医师，从事畜牧兽医和实验室相关检测工作。
