干细胞与心肌再生

龚惠，陈志丹，邹云增

（复旦大学附属中山医院上海市心血管病研究所，上海200032）

干细胞与心肌再生

龚惠，陈志丹，邹云增

（复旦大学附属中山医院上海市心血管病研究所，上海200032）

由于成年心肌细胞通常不能再生，严重的心肌损伤会导致心肌不可逆的重构坏死，从而发生心功能失调.干细胞再生治疗为心肌再生提供了很好的策略.为了寻找合适的干细胞类型，促进心肌再生，有效改善心功能，需要更好地了解心肌修复和再生的分子基础.已有研究发现多种干细胞可促进心肌再生.描述了骨髓干细胞的促血管新生及心肌分化的能力在心梗治疗中的作用，还讨论了心脏侧群干细胞以及诱导型多能干细胞在心肌再生中的作用和分子机制.所阐述的最新数据有利于拓展干细胞治疗的有效潜能及临床影响.

干细胞；心肌再生；骨髓干细胞；心脏侧群干细胞；诱导型多能干细胞

冠心病及高血压等原因会引起心肌缺血，心脏发生重构以代偿心功能，在病理性刺激持续存在的情况下，心脏功能向失代偿转变，最终发展成为心力衰竭［1］.心力衰竭的预后非常差，5年病死率高达50%以上，严重威胁人类健康，被认为是“心血管疾病中尚未攻克的堡垒”.由于成年心肌细胞通常不能再生，心脏移植成为治疗重型心力衰竭的唯一有效途径.但由于心脏供体的严重匮乏，成千上万的心力衰竭患者在等待中死亡.而干细胞具有增殖和分化潜能，是器官发育和组织修复的基础.寻找合适的干细胞类型，促进心肌再生，有效改善心功能是心肌再生治疗领域的研究热点.

1　骨髓干细胞与心肌再生

在所有干细胞类型中，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）促进心肌再生的相关研究最早.MSC最初在骨髓中被发现，在体内或体外特定诱导条件下，可分化成多种组织细胞包括心肌及内皮等［2］.由于MSC来源广、易培养，具有较强的分化潜能和可以自体移植等优点，为各种心肌细胞坏死性疾病提供了一条新的有效的治疗途径，被认为是即将引入临床治疗的最优干细胞.国际上将骨髓干细胞移植用于治疗心肌梗死始于2001年［3］.除急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）外，其他心脏疾病如陈旧性心肌梗死、重症心绞痛、严重心肌病以及由各种原因引起的心力衰竭等也都涉及心肌细胞的坏死，同样可以施行自体骨髓干细胞移植治疗［3］.

临床试验结果表明，冠脉内骨髓干细胞移植可改善急性心肌梗死后左室收缩舒张功能及冠脉血流储备［4］.复旦大学附属中山医院临床研究也证实，同种异体骨髓MSC对急性心肌梗死的心功能改善起到积极的作用，对慢性心梗病人的治疗虽然没有提高心脏的左室收缩功能，却能改善舒张功能.不过MSC移植后存活率低等问题严重影响其对心功能的改善效果.复旦大学附属中山医院的临床团队尝试多次冠脉内注射MSC，观察到多次注射比单次注射对大面积心梗的心功能恢复作用更明显［5］，并且观察到急性心梗后4～7 d是最佳移植时间，能够明显降低再次血运重建率、死亡或再次心肌梗死的联合发生率等［4］.这主要是因为处于这个时间窗的心肌弹性可能更有利于移植细胞的存活和分化［6］，心脏微环境对移植后MSC在体内的存活及分化有重要的作用.

尽管MSC移植治疗心梗是非常有临床价值的，但其具体机制并不十分清楚.有学者认为，除了MSC分化成心肌细胞或血管细胞等细胞外，其通过旁分泌作用修复心肌或促进血管新生也产生一定的作用［7］.因此，探索MSC移植促进心肌再生及改善心功能的机制，采用多种手段协同改善MSC的存活及分化，有利于突破MSC移植效率低的瓶颈，从而更有效地治疗心梗后心衰.

2　心脏侧群干细胞与心肌再生

侧群（side population，SP）细胞是一种特殊类型的干/祖细胞，最初是1996年Goodell等［2］在分离纯化小鼠骨髓造血干细胞时分离和鉴定出的，其发育和分化状态可能介于胚胎和成体干细胞之间，仍具有很强的多向分化潜能和增殖特性，能参与相应组织的更新与再生.由于SP细胞具有将荧光染料Hoechst 33342泵出细胞外的特性，利用这一特性并结合荧光激活细胞分选法可对SP细胞进行分离纯化，且因其在流式二维分析点阵图上呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧，因此被称为SP细胞.自2002年以来，不断有证据表明，心脏中也含有SP细胞，即心脏侧群细胞（cardiac side population cells，CSPs）.CSPs具有干细胞特性，表达一些干细胞的标志，如Sca-1，Mdr1，c-kit等，因此CSPs细胞实际是心脏成体干细胞的集合，是研究心脏原位修复的重要方向［8］.

CSPs具有干细胞的特点，能够增殖形成克隆并分化为心肌细胞、内皮细胞、脂肪组织等多种细胞类型［9-10］.在生理状态下CSPs维持极低水平的增殖更新，发生心肌梗死后，SP细胞的增殖水平快速提高，然后逐步降低.已有研究表明，心梗后心脏中有一部分来自骨髓中的SP细胞驻留心脏，转化为CSPs［11］，提示CSPs的增多有可能对修复心肌有重要作用.然而在各种病因所致的心肌损伤中，心肌再生和修复还是有很大的局限性.究竟是CSPs更新水平不够、数量有限，还是缺乏合适的微环境介导CSPs的增殖分化从而导致心肌损伤的不可逆发生？这些问题都有待进一步研究.

本研究团队试图找到激活CSPs，唤起心脏的自我修复能力的方法.前期研究观察到粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）还可以直接活化心肌细胞STAT3信号抑制心肌细胞凋亡［12］.已有研究表明，G-CSF能够促使骨髓干细胞向损伤的心脏趋化成为CSPs，发挥修复心肌的作用［13］.因此，G-CSF被看作有潜力治疗心肌梗死的药物而进入临床试验阶段.另外，本研究团队在CSPs表面还发现UrotensinⅡ（UⅡ）受体的存在.与G-CSF受体不同，UⅡ受体的活化并不能促进CSPs的增殖能力，而是通过活化JNK信号通路抑制其增殖能力［14］.在压力超负荷小鼠的心衰模型中，观察到血清中UⅡ明显上升，使用Urantide阻断UⅡ受体能够促进压力超负荷小鼠CSPs增殖，提高心脏修复能力，改善心脏功能［15］.因此，如何制定最佳药物组合，促进CSPs增殖和分化，最大程度地提升心脏自我修复潜力将是未来的研究方向.

3　诱导多能干细胞与心肌再生

2006年Takahashi等［16］通过特定基因的表达将完全分化的成年细胞重新编程为类似胚胎状态的全能性或多能性的细胞，即诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）.由于iPSCs可由体细胞直接转化而来，具有来源广泛、取材便捷、免疫相容性高等优点，并且其生理特性接近胚胎干细胞，是研究组织再生包括心肌再生的重要工具.iPSCs技术也被认为是干细胞研究领域的一个里程碑式的突破，具有巨大的潜在应用价值.

但要真正将iPSCs应用于临床治疗心血管疾病，还需先解决以下几个问题：①iPSCs自发向心肌细胞分化的效率极低，并且分化后的功能不成熟；②iPSCs有成瘤性的风险，因此需要研究iPSCs向心肌细胞高效分化的机制，建立稳定的定向分化技术体系，并尽可能筛选纯化心肌细胞以进行移植，避免直接iPSCs治疗可能引发的肿瘤风险.

各研究团队大多通过化学小分子预处理或者直接导入心肌分化相关基因促使iPSCs向心肌细胞分化［17-18］.本研究团队利用蛋白组学技术，分析了二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）诱导P19CL6细胞向心肌细胞分化的不同时间点的表达蛋白谱差异，从中筛选出重要调节因子——核小体组装蛋白类似蛋白1（nucleosome assembly protein 1-like 1，Nap1L1）［19］. Nap1L1是一种核小体组装蛋白，参与DNA复制和核小体组装，并且能促进细胞包括iPSCs的增殖［20-21］.本研究团队分别构建了Nap1L1敲减和过表达的iPSCs系，iPSCs的多能干性并未受到影响.在相同分化培养条件下，下调Nap1L1表达使iPSCs向心肌细胞分化的比率增加近5倍，分化的心肌细胞具备正常心肌细胞的结构和功能特征.通过构建诱导型的Nap1L1过表达iPSCs系，明确了Nap1L1能够调控中胚层的分化，从而调节心肌分化.同样地，下调Nap1L1可明显促进iPSCs向平滑肌以及内皮细胞的分化.已有研究表明，notch信号抑制可明显促进中胚层的分化以及心肌和血管细胞的分化，进一步的研究表明Nap1L1调控中胚层及心肌分化是通过调控notch信号活性来实现的［22］.上述研究结果提示心肌细胞的分化是个非常复杂的过程，通过单一因素特异性地促进iPSCs向心肌分化存在很大的局限性.本研究团队还观察到，在心脏晚期发育过程中起重要作用的胰岛素生长因子结合蛋白4（insulin-like growth factor binding protein 4，IGFBP4）也可促进iPSCs向心肌细胞分化，具体机制主要是通过抑制wnt信号β-catenin从而促进分化的心肌细胞增殖［23］.杨黄恬研究组通过11株不同的iPSCs系统筛选出了16种心肌细胞分化诱导物，发现只有抗坏血酸（ascorbic acid，AA）起到了一致和高效的诱导iPSCs向心肌细胞分化的作用.通过比较不同浓度和不同分化时段AA的处理，建立了简单、经济、高效的诱导iPSCs向心肌细胞分化的体系，可将小鼠和人iPSCs向心肌细胞的分化效率分别提高约7.3倍和30.2倍，并明显缩小不同iPSCs系间包括不具有自发心肌细胞分化潜能的iPSCs间心肌细胞的分化差异［24］.

虽然iPSCs为心血管研究尤其是心肌再生提供了新的机会，但将iPSCs真正应用于临床还存在若干问题.在了解iPSCs向心肌分化机制的基础上，利用基因干预技术以及小分子化合物的诱导作用，协同促进iPSCs向心肌细胞分化，从而用于损伤心肌的修复，这是未来需要进一步发展的治疗策略.

4　结束语

综上所述，尽管干细胞为心肌再生提供了广阔的应用前景，但有些问题亟待解决.2014年美澳两国科研人员利用人类干细胞，在动物实验中成功修复了猴子受损的心脏，实现了心肌再生，为推动相关技术早日进入临床试验阶段带来新的希望.而如何通过基因及化学药物技术最大程度地提高移植细胞的存活率，使各类干细胞发挥自身优势促进人类心脏损伤后的心肌再生，是干细胞研究者们正在努力的目标.

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Stem cells and cardiac regeneration

GONG Hui，CHEN Zhidan，ZOU Yunzeng
（Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Human myocardium has poor regenerative power，and significant myocardial injury results in irreversible damage，remodeling，and dysfunction.Stem cells enable promising regenerative strategies for cardiovascular diseases.The search for suitable stem cell phenotypes that will improve myocardial regenerative ability needs better understanding of the molecular mechanisms of repair and regeneration.Previous reports have suggested that several stem phenotypes regulate myocardial regeneration in vitro and in vivo. This review describes the therapeutic potential of mesenchymal stem cell（MSC）therapy in terms of angiogenic and regenerative capacity after myocardial infarction.In addition，the effect of cardiac side population cells（CSPs）and the differentiation of induced pluripotent stem cells（iPSCs）in cardiac regeneration are discussed.The review provides recent data and helps broaden therapeutic potential and clinical impact of stem cell therapy.

stem cell；cardiac regeneration；mesenchymal stem cell（MSC）；cardiac side population cells（CSPs）；induced pluripotent stem cells（iPSCs）

R 34

A

1007-2861（2016）03-0280-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.016

2016-04-20

国家自然科学基金资助项目（81370258）；上海市科委资助项目（13JC1401703）

龚惠（1975—），女，副研究员，研究方向为干细胞和心力衰竭.E-mail：ghui1975@163.com