血清MicroRNA作为生物学标记物对肝硬化诊断及预后判断研究进展

麻树霖陈征综述，刘晓峰审校

血清MicroRNA作为生物学标记物对肝硬化诊断及预后判断研究进展

麻树霖陈征综述，刘晓峰审校

MicroRNA（miRNA）在生物体生长、发育及疾病发生发展等过程中都起着十分重要的作用。近期的实验表明，部分血清miRNAs在肝硬化患者水平差异较大，对肝硬化的诊断具有高度敏感性和特异性，提示血清miRNAs可作为潜在的生物学标记物用于肝硬化的临床诊断及预后判断。

肝硬化；miRNA；诊断；预后判断

肝硬化是肝脏在慢性炎症刺激下，肝小叶重建、假小叶和纤维结节形成的组织学发展过程。在中国乙型肝炎病毒的携带率高达7.18%，同时，近年来酒精性肝硬化、非酒精性脂肪肝发病率也呈上升趋势。其中，乙型病毒性肝炎被认为是导致肝硬化的主要原因，其带来的公民健康损害和社会负担是难以估量的。据保守估计我国现有9300万乙型肝炎病毒感染者，是全球HBV感染人数最多的国家。目前的医疗水平尚不能清除人体内的HBV，致使该病迁延难愈。肝硬化并发症包括：食管胃底静脉曲张、腹水、脾机能亢进、自发性细菌性腹膜炎、肝性脑病等，同时肝硬化还是肝恶性肿瘤的高危因素之一。据统计，慢性HBV感染者约有15%～25%可能会因罹患HBV相关的肝硬化和原发性肝细胞癌而过早死亡［1］。近几年来，越来越多的研究发现miRNAs作为一类保守的非编码RNA在肝硬化患者血清中表达异常［2］。而血清和血浆中含有来源于不同组织和器官的稳定miRNAs，提示血清MiRNAs可能作为一种新的生物学标记物用于疾病的无创检查［3］。本文就血清miRNAs在临床肝硬化诊断及预后分析方面的研究进展进行综述。

1　现有肝纤维化诊断方法的局限性

传统肝硬化的诊断方法主要包括影像学、病理学和血清学三大类。（1）影像学检查作为无创检查普遍应用于临床工作，对于早期肝硬化化，影像学（超声、CT、MR）诊断往往较为困难，而实时组织弹性成像技术容易受肥胖、腹水、肝脏周围大血管、肋间隙狭窄等因素的影响；（2）病理学（肝脏穿刺活检）是肝硬化诊断的金标准，是明确诊断，衡量炎症活动度，以及判定药物疗效的重要依据，为避免肝穿刺的盲目性、肝脏病变的不均一性而导致抽样误差，往往需要用粗针穿刺，标本长度要求在1cm以上，并至少在镜下包括6个以上汇管区，这导致肝穿刺活检创伤较大，难以重复活检，且并发症也较为常见（约1/3的患者有疼痛；0.3%的患者出现严重的并发症，包括出血、气胸、结肠和胆囊穿孔等）［4］；（3）血清学肝硬化指标主要包括细胞外基质成分、胶原酶类和细胞因子三大类，这其中以细胞外基质成分较为常用。国外提出综合多项有价值的血清学指标建立诊断肝硬化的数学模型，如Fibrotest评分系统、AST/血小板指数（APRI）、FibrospectⅡ评分系统。但是，由于受到多方面结缔组织代谢的影响，单项指标只能反映肝硬化的某个方面，对诊断肝硬化的准确性不高，导致其判断作用是有限的，有时甚至是不可靠的。因此，进一步提高肝硬化血清学诊断的敏感度和特异度需要继续寻找新的能反映肝硬化程度的血清学指标。

2　MiRNA与肝硬化的关系

MiRNA是一类广泛存在于真核生物中，长度为20～25nt的非编码调控单链小分子RNA，它通过与目标mRNA分子的3'端非编码区域完全或不完全互补结合，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译［5］。MiRNAs在形成肝纤维化并向肝硬化发展中扮演着重要的角色，它通过作用于信号转导通路调节肝星状细胞（HSC）的增殖与转化影响肝纤维化向肝硬化发展的进程［6］。MiRNAs还可以促进核转录因子kappa B（NF-κB）的表达，从而抑制人HSC的凋亡［7，8］。研究发现，肝纤维化的发生与发展受基因甲基化的调控［9］。甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）是甲基化结合蛋白家族中的主要成员，它通过与甲基化DNA的特异性结合，抑制其下游靶基因的转录，起到转录调节的作用，而某些miRNAs，如mir-132的下调表达可阻碍MeCP2的转录，进而抑制MeCP2与过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的结合，同时削弱MeCP2对EZH2基因激活效应，从而抑制HSC的活化，减缓肝纤维化发展为肝硬化的进程［10］。

3　血清miRNAs作为生物学标记物的潜力

越来越多的研究发现，血清中存在大量来源于不同组织和器官的稳定miRNAs，它们由细胞主动且可控地分泌释放入血液，同时这些miRNAs在不同个体间的识别还具备可重复性和一致性［11～14］。此外，血清miRNAs还具有非常强的稳定性、可再生性、对RNA酶的耐受性［13～16］。大量实验已证明，在经过长期的室温放置、多次冻融、高温及强酸、强碱处理的情况下，血清miRNAs仍能保持其稳定性，而在同样的恶劣条件下，蛋白质类生物标记物则会出现不同程度的降解［12，17］。MiRNAs在血清中之所以能够稳定存在可能主要受两方面条件保护：（1）血清中miRNAs通过与RNA结合蛋白或脂蛋白复合物结合而提高其稳定性；（2）血清及血浆中的miRNAs被包裹在细胞膜微粒（外泌体、微泡、凋亡小体等）中，进而避免被RNA酶降解［11，18～21］。此外，MiRNAs在病毒性肝炎、肝脏损害、肝硬化、肝癌及其他肝脏疾病患者的血清中均呈现差异性表达［18，22～25］。越来越多的miRNAs被证明在肝硬化患者血清中表达异常，血清中miRNAs的这些特点提示其可以作为生物学标记物用于肝硬化的临床诊断及预后分析［26］。

4　肝硬化患者血清MiRNA的差异

4.1肝硬化患者血清mir-101水平差异研究者通过对miRNAs表达谱进行分析发现mir-101在肝细胞癌（HCC）组织中表达上调，Wei等人则发现在乙型病毒性肝炎（CHB）患者中mir-101在HBV-X蛋白的影响下表达下调，并且在乙肝相关性肝细胞癌（HBV-HCC）组织中引发表观遗传学改变［27，28］。此后，Xie等人通过对CHB、乙型病毒性肝炎相关性肝硬化（HBV-LC）及HBV-HCC三类患者及健康人的血清中miR-101进行分析发现：CHB组与对照组血清miR-101浓度没有显著差异；HBV-LC组miR-101水平明显高于CHB组和对照组；HBV-HCC患者血清中miR-101相比于HBC-LC、CHB和对照组则出现明显下调。通过对实验数据的ORC曲线分析，他们发现血清mir-101在鉴别诊断肝硬化和肝细胞癌时的灵敏度和特异度分别为95.5%和90.2%，提示血清mir-101可作为区分HBV-HCC和HBV-LC的潜在无创性生物学标记物。为了研究HBV-LC发展为HBC-HCC的风险与miR-101之间的关系，Xie利用二元逻辑回归将性别、年龄、饮酒情况和血清ALT水平控制在同一水平，然后对实验数据进行分析，发现血清miR-101的表达下调与高HBV-HCC的风险密切相关。在之后的研究中，他们还发现在诊断由HBV-LC进展而来的HBV-HCC时，血清miR-101优于血清甲胎蛋白（AFP），而二者联合用于HBV-HCC的诊断相比于血清miR-101单独用于HBV-HCC的诊断则没有明显优势。因此他们认为，miR-101可作为一种新的无创生物学指标用于HBV-LC的临床诊断，对CHB向HBV-LC进展的情况进行有效监控并及时发现由HBV-LC发展而来的HBV-HCC［29］。

4.2肝硬化患者血清中miR-375的差异研究显示miR-375基因在活化期肝星状细胞中下调表达，并证实miR-375通过DNA甲基化作用参与了肝星状细胞转化为肌成纤维母细胞的过程，而这一过程是肝硬化形成的中心环节［30-32］。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上，70%-90%的CpG分散于DNA序列中，呈低甲基化状态，另一种集簇存在，称为CpG岛，位于转录调控区附近，处于非甲基化状态，DNA复制后启动子CpG岛序列内的5′胞嘧啶被甲基修饰，导致DNA结合蛋白与DNA主螺旋沟的结合能力降低，从而抑制基因的转录活性。Mir-375启动子区存在CpG岛，miR-375通过甲基化作用沉默特定基因的表达，控制蛋白转录翻译、细胞生长、迁移和抗凋亡等生物效应，从而影响肝硬化的发生与发展［31］。在另一研究中，研究者通过基因芯片技术对肝硬化患者血清中miRNAs进行高通量分析，筛选出明显差异表达的miRNAs并进行PRC分析发现，包括miR-375在内的一系列miRNAs与正常人相比呈明显的差异性表达［2］。在不久的将来，我们或许可以通过分析血清miR-375的表达水平对肝硬化的进展情况进行有效检测。

4.3肝硬化患者血清中miR-181b的差异研究发现miR-181b通过作用于p27基因促进HSC的增殖分化，而转化生长因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）则可以诱导miR-181b表达上调［33］。Wang分析了22位肝硬化患者和17位健康人的血清miR-18a和miR-18b水平，发现肝硬化患者血清miR-18b水平明显高于健康人，表明血清miR-18b或许可以作为肝硬化的潜在生物学诊断标记物［34］。

4.4肝硬化患者血清mir-122的差异Zhang研究发现，血浆Mir-122比血清转氨酶更早的反应了肝脏的损害，而Trebicka等人对小白鼠的研究表明miR-122的血清水平在对乙酰氨基酚诱导的肝脏损伤中升高，并且比其他指标更早的反应了肝细胞的破坏［23，35］。Waidmann et al从107位肝硬化实验组患者和143位对照组患者血清中提取Total RNA，并对miR-122进行qPCR分析，发现肝功能失代偿期肝硬化患者血清中miR-122水平低于代偿期的肝硬化患者血清中miR-122水平，合并腹水，自发性腹膜炎和肝肾综合征的肝硬化患者血清中miR-122水平明显低于未合并有上述并发症的患者血清中mir-122水平。对实验数据进行多变量Cox回归分析可以发现miR-122的血清水平是独立于MELD评分，性别和年龄的肝硬化生存率相关因素。因此血清miR-122水平被认为是一种用于评价肝硬化患者的预后的新的潜在指标参数［36］。

4.5肝硬化患者血清miR-571和miR-652的差异Christoph Roderburg的研究团队通过对大样本量的肝硬化病人队列进行miRNAs高通量分析及qRT-PCR分析，发现了一系列miRNAs在肝硬化患者血清中表达异常。其中在以往研究中并未引起重视的miR-571和miR-652在肝硬化患者血清中呈显著的差异性表达。肝硬化患者肝细胞中miR-571在促纤维化因子TGF-β的作用下表达上调，而其在血清中的表达水平出现了同步的上调。同时，血清miR-571水平变化还与肝硬化等级密切相关。此外，Mir-571在肝硬化患者循环单核细胞和血清中的浓度水平出现了一致的的下调表达。提示血清miRNAs不仅可以反应肝硬化的发展进程，还通过固有免疫细胞的炎症信号通路调节包括肝纤维化在内的各种慢性炎症反应。miR-571和miR-652的这些特点定义了一种新的调节网络，并为今后慢性肝病及肝硬化的miRNA诊断及治疗提供了一定的理论基础［5］。

4.6硬化患者血清中miR-106b的差异性MiR-106b在转录后水平负调节多个基因（如TGF-β、p21/CDKN1A和ULK1基因）的表达，其中TGF-β可以通过调节结缔组织生长因子（CTGF）的表达促进肝纤维化的形成，暗示miR-106b参与了肝硬化的发生与发展［37］。Chen通过对肝硬化患者血清miRNAs进行基因芯片分析发现miR-106b、miR-122及miR-144在肝硬化患者血清中下调表达，而miR-181d，miR-181b则呈明显上调表达。其中，血清miR-106b在检测早期CHB-LC病人方面取得令人满意的效果。此外，研究发现血清miR-106b可作为潜在的生物学标记物用于监控肝硬化由代偿期向失代偿期的转变，为肝硬化的临床治疗提供重要参考［33］。

4.7肝硬化患者血清中miR-33a的差异Mir-33a最近已成为一个研究热点。Mir-33a作为一种新的生物学标记物被证明其血清浓度水平与肝硬化的进展情况有密切的联系，研究表明，mir-33a不仅可以调节体内的脂质和胆固醇的代谢平衡，还与HSC的激活及肝脏细胞外基质的产生有关。通过研究纤维蛋白酶原基因的表达和mir-33a在肝纤维化中的相关机制，Li等人发现，伴随着CHB患者肝纤维化的发展，血清mir-33a水平呈现升高趋势，并且与I型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白翻译水平显著相关。另外，实验表明，mir-33a在人类肝星状细胞和LX-2细胞中的表达水平高于肝癌细胞。暗示mir-33a在肝纤维化的发病机制中具有重要的作用，除了其他常见的诊断方法（如肝脏瞬时弹性成像技术，传统血清指标）外，mir-33a可以作为一种新的工具用于早期肝硬化的诊断［38］。

4.8肝硬化患者血清中miR-29的差异肝硬化患者血清、肝星状细胞中miR-33a的表达水平明显下降，提示miR-29不只是可以用于治疗，或许还具有作为生物学标记物检测人类肝纤维化的潜力。MiR-29在慢性病毒性肝炎和肝纤维化病人中异常表达，而在原发性胆汁性肝硬化样本中无明显的表达异常，表明miR-29在不同病因的肝脏疾病之间的表达水平存在差异，提示血清miRNAs可用于鉴别诊断不同类型的肝硬化［39］。

5　总结与展望

随着不断的研究，越来越多的miRNAs被发现在肝硬化患者血清中呈差异表达。对慢性肝病及肝纤维化病人的分组研究表明，包括miR-29a，miR-197-3p，miR-505-3p，miR-652，miR-20a，miR-21，miR-34a，miR-122，miR-133a，miR-223，miR-571，let7等一系列标志物在血清中异常表达，其中几个标志物与肝纤维化的程度相关。尽管血清中miRNAs水平的调控与他们在肝纤维化相关的特定细胞中的功能之间的联系尚不明确，但是血清miRNAs作为生物学指标具有良好的稳定性、可重复性等优点，血清miRNAs测定或许可以作为一种新的检验方法用于肝硬化的临床诊断及预后分析。更值得我们期待的是，下一代的深度测序（next generation sequencing，NGS）已经能够胜任生物体液中miRNAs的检测工作，NGS或许可以成为miRNAs生物学标记物检测的可行方法［40，41］。通过确立规范化的样本采集、处理、提纯及数据分析标准，血清miRNAs测定将有望成为肝硬化临床诊断及预后判断的重要参考指标。

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（收稿：2015-09-09）

（本文编辑：朱传龙）

Serum MicroRNA in diagonsis of patients with liver cirrhosis

Ma Shulin，Liu Xiaofeng.
Department of Gastroenterology，Military General Hospital，Jinan 25000，Shandong Province，China

MicroRNAs（miRNAs）have emerged as master regulators in several biological processes.More and more studies have shown that serum miRNAs levels differ in liver cirrhosis.Serum miRNAs may serve as a potential biomarker for dignosis and prognosis of patients with liver cirrhosis

Liver cirrhosis；miRNA；Diagnosis；Prognosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.033

250000济南市济南军区总医院消化内科

麻树霖，男，26岁，硕士研究生。主要从事肝纤维化发病机制的基础及临床研究

刘晓峰，E-mail：liuxf0531@126.com