坏死性凋亡在肝炎以及其他肝病发病中的作用研究进展*

宋金玥，任锋综述，张桓虎审校

坏死性凋亡在肝炎以及其他肝病发病中的作用研究进展*

宋金玥，任锋综述，张桓虎审校

传统意义上，人们将细胞死亡分为凋亡和坏死两类，而越来越多的研究结果表明坏死性凋亡是一种不同于坏死或凋亡的细胞死亡途径，并在多种疾病发病中发挥着重要作用。坏死性凋亡是调节坏死的一种形式，可以被死亡受体的配体激活，或者在无凋亡状态下被能够诱导死亡受体表达的刺激激活。死亡受体配体对坏死性凋亡激活需要RIP1激酶活性，其进一步介导RIP3和MLKL的激活。RIP3和MLKL是坏死性凋亡下游重要的调节子。RIP1激酶是坏死性凋亡通路中的关键药物靶点，通过坏死抑制素阻断RIP1活性，可以抑制坏死性凋亡的激活，并且在死亡受体配体存在的情况下使得细胞生存和增殖。本文将对坏死性凋亡与凋亡和坏死的区别、坏死性凋亡产生机制及其在肝炎以及其他肝病发病中的作用作一介绍，以期对肝病治疗药物新靶点的发现提供新思路。

肝炎；坏死性凋亡；坏死；凋亡

程序性细胞死亡对多细胞生物生长发育和成年生活过程中单个细胞的命运调节起到重要作用。多种细胞程序性死亡机制已在不同领域被确定。细胞凋亡是由caspase家族介导的一种细胞死亡形式。坏死被认为是细胞死亡的另外一种形式：表现为早期的质膜通透性增加和细胞器肿胀。坏死性凋亡（necroptosis）的定义为：一种与坏死具有相似的形态学特征（早期包膜完整性被破坏，细胞体积及胞内细胞器肿胀），但其细胞死亡方式为可调控的非caspase依赖性的程序性细胞死亡，即在caspase抑制的条件下，死亡受体与配体的结合可触发坏死性凋亡。研究发现，坏死性凋亡不仅参与机体的生理性调节过程，而且还参与疾病的发生、发展及预后，如神经变性性疾病、缺血性疾病、炎症、病毒感染性疾病等。本文将对坏死性凋亡与凋亡和坏死的区别、坏死性凋亡产生机制及其在肝病发病中的作用作一综述，以期对肝病治疗药物新靶点的发现提供新思路。

1　凋亡、坏死和坏死性凋亡

1.1细胞凋亡细胞凋亡是细胞受环境刺激后，在基因调控下所产生的一种自然死亡现象，失去作用或已经受损的细胞会在含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）诱导下启动程序性的自我毁灭过程。凋亡发生时，细胞皱缩、密度增加、染色质浓缩，进而细胞核裂解、细胞膜内陷形成凋亡小体，从而避免炎症反应的发生。细胞凋亡主要包括两条信号通路，即外源性通路（由细胞膜上的死亡受体介导）和内源性途径（由线粒体应激和内质网应激启动）。这两条途径均需要caspase的活化及其级联反应。凋亡则是一种调控性的细胞死亡机制，有的将其称作“程序性细胞死亡”或“自杀性细胞死亡”［1，2］。

1.2细胞坏死细胞坏死是指在外界剧烈的物理、化学和生物损伤情况下，受损细胞和组织代谢完全停止而发生的细胞死亡。在正常生理情况下，由于生理性的创伤导致内环境渗透压改变失去平衡，最终出现细胞偶然性死亡。但是，在外界严重压力之下，呈现坏死状的细胞可出现快速的细胞膜完整性丧失、细胞膜因摄取大量水分而肿胀破裂、线粒体功能异常等特征。由于膜的破裂导致细胞内大量成分外泄，进而可引起周围组织的炎症反应。细胞坏死是人们早期从病理形态学上的特点来认识和定义细胞的一种死亡方式，它是一种在外界巨大压力下所导致的细胞被动死亡［3，4］。

1.3坏死性凋亡及其信号分子2003年，Chan et al首次对“坏死性凋亡”作了解释，即它是一种受体相互作用蛋白（RIP）介导的细胞死亡形态，其形态不同于细胞凋亡，依赖于肿瘤坏死因子受体，Fas和肿瘤坏死因子（TNF-α）相关的细胞凋亡引发配体（TRAIL）受体的激活［5］。RIP蛋白在坏死性凋亡执行过程中发挥着关键性作用，例如促坏死复合体的形成，RIP1和RIP3的激酶激活是坏死小体形成和调控过程中所必需的［6］。目前，坏死性凋亡的启动子众多，但只有TNF-α诱导的坏死性凋亡被广泛研究并报道［7，8］。

凋亡和坏死性凋亡均可由细胞膜上的死亡受体（DR）所启动，但是坏死性凋亡经历了由RIP介导的中间过程，这是将坏死性凋亡与其他依赖DR的凋亡途径相区别的重要特点。RIP是一类Fas相互作用蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。它包含3个结构域，分别为N-末端激酶结构域、中间结构域和C-末端的可与TRADD结合的结构域。目前，已发现3种与RIP同源的激酶，即RIP1、RIP3和RIP4，它们的N-末端激酶结构域极其相似，但具有不同的C-末端。

RIP1是决定细胞生存和死亡的关键激酶，它包括三个结构域：一个是坏死性凋亡所必须的丝氨酸/苏氨酸激酶域；一个是与NF-κB相互作用的中间域；另一个是用于凋亡激活的死亡结构域［9］。RIP1泛素化促进细胞生存通路，而去泛素化则促进激酶依赖的细胞死亡途径［10］。RIP1有多个结构域，其激活可以导致多个结果，例如NF-κB激活、增殖蛋白激酶（MAPK）激活、细胞凋亡或坏死等［11］。研究结果认为，RIP1是凋亡性坏死所必须的分子，而不是其他的信号通路［6］。坏死性凋亡特异性抑制剂（Necrostatin-1）是一个小分子，它可以阻断RIP1激酶活性，从而抑制死亡受体诱导坏死性凋亡［12］。Cho［6］报道称RIP3可以控制坏死性凋亡，并增强RIP1对坏死小体的募集。此外，除了RIP1和RIP3以外，其他激酶也被认为参与了RIP1和RIP3的磷酸化。

研究表明，激活的RIP3可以进一步激活许多下游的不同信号，通过坏死小体的形成、混合线性激酶样结构域（MLKL）的激活、磷酸甘油酸脂变位酶5（PGAM5）、最后通过动力蛋白相关蛋白（Drp1）诱导活性氧的产生和膜透性［13］。通过JNK的活化，RIP1/RIP3激酶级联调节线粒体氧化应激［14～16］。RIP3表达可增加促炎细胞因子表达［15～17］以及与炎症小体激活［17］相关；RIP3参与了能量代谢并决定了细胞凋亡和死亡之间的转换［18］；RIP3抑制增加了同种异体移植物在肾缺血再灌注损伤模型中的存活率［19，20］。

2　坏死性凋亡与炎症反应

细胞死亡和炎症在病理学中是相互关联的生理现象。由坏死细胞释放细胞内容物触发炎症反应，而炎症因子进一步促进细胞死亡，构成一个循环回路。作为坏死性凋亡关键因子的RIP1和RIP3直接参与了炎症反应的免疫调节。研究表明，在L929细胞中，RIP1激酶通过EDD和SpP1调节的转录机制促进zVAD诱导的TNF-α产生［21］。最新的研究证明，在原代细胞中，包括巨噬细胞和树突状细胞，RIP1激酶在调节炎症反应作用方面表现出相似的作用：在巨噬细胞中，TNF-α/zVAD诱导的趋化因子CXCL-1的产生依赖于RIP1激酶的激活［22］；在树突状细胞中，caspase-8缺失导致细胞系统性自身免疫性增加，并且导致细胞对TLR配体的敏感性增强，产生大量的促炎细胞因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12。有趣的是，在RIP3不参与的情况下，RIP1激酶激活也有利于炎症因子的产生［23］。在caspase-8失活的情况下，由RIP1激酶诱发的炎症反应更加容易被引发，这说明了caspase-8是一个重要的炎症反应抑制因子。因此，RIP1激酶是调节细胞死亡和炎症的一个关键调节子，阻断RIP1激酶可能抑制细胞死亡和炎症反应，这些都有利于人类疾病病理损伤的改善。RIP3参与了不同的炎症反应通路称为NLRP3炎症小体，既在细胞死亡前，TLR4参与导致炎症小体的形成，抑制坏死性凋亡通过依赖RIP3活性而限制IL-1β炎症因子的产生［24］。综上所述，在人类疾病的动物模型中，给予坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1对动物病理损伤的改善作用至少部分是由于减轻炎症反应而达到的，而不仅仅是通过促进细胞生存。

3　坏死性凋亡与肝病

肝细胞死亡存在于几乎所有类型的人类肝脏疾病中，可作为由于病毒、毒物、代谢或者自身免疫性损伤引起各种急性和慢性肝脏疾病的敏感检测指标。临床和动物模型的研究表明，肝细胞死亡是肝脏疾病进展的关键启动子，表现为随后的炎症、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。在不同的疾病中，肝细胞死亡方式表现出不同的形式，例如凋亡、坏死和坏死性凋亡，其中坏死性凋亡在不同肝脏疾病的发病机制中承担着重要的作用。

3.1急性肝炎急性肝损伤可以通过不同的刺激诱发，例如由竞争性anti-Fas抗体或LPS诱导、由对乙酰氨基酚刺激、或者在刀豆蛋白（ConA）诱导下均能引起细胞凋亡而引发细胞死亡。研究表明，给予Nec-1可以通过减少肝细胞坏死性死亡引起的LDH和HMGB1的释放而减轻ConA诱导的急性肝炎，同时增加RIPK3的表达［25］。另一项研究表明，肝细胞的特异性删除caspase-8表达可增加ConA诱导条件下坏死性损伤，主要通过抑制caspase-8介导的RIPK1的裂解而促进坏死小体的形成［26］。

对乙酰氨基酚（APAP）毒性诱导RIP3表达，增加谷丙转氨酶（ALT）水平，并导致广泛坏死。针对RIP3为靶点的反义morpholinos干预和使用RIP3缺陷小鼠不仅降低了ALT水平和氧化应激，也改变了线粒体的功能。体外实验表明，RIP3减少降低了JNK和Drp1的激活，随后进一步抑制了线粒体氧化应激、裂解，最后抑制了细胞坏死。体内实验也证实，RIP3缺陷小鼠和RIP3反义morpholinos通过减少JNK和Drp1的激活和异位，使体内坏死性细胞死亡减少［16］。类似的结果也在另外两个研究中报道，nec-1干预可以减轻APAP诱导肝细胞毒性，并且RIP1/RIP3通过调控JNK激活而发挥作用［14，27］，或者通过Dabrofenib干预RIPK3激酶活性也可以减轻对乙酰氨基酚诱导的急性肝炎［28］。

3.2酒精性肝病酒精性肝病是由于长期摄入过多的乙醇而引发的肝病。前期研究表明，通过泛硫胱胺酸蛋白酶抑制剂（Pan-caspase inhibitor）抑制细胞凋亡并不能充分的预防酒精性肝损伤［29］。最近两项研究表明，给予乙醇长期喂养的小鼠肝脏中能检测到RIPK3的表达增加，与酒精性肝病患者的肝脏组织活检结果一致［30］。此外，Ripk3缺失的小鼠缓解了酒精性肝损伤和炎症的损害［26］。然而，Nec-1预处理并没有对酒精性肝损伤产生影响。以上不同结果表明，可能RIPK以独立形式参与酒精性肝病，或者是Nec-1药物代谢动力学存在问题［31，32］。

3.3非酒精性脂肪肝疾病非酒精性脂肪肝主要是由于脂肪积累或胰岛素抵抗而引起的一类肝脏疾病［33］。特别是对于非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其与炎症和细胞凋亡造成的肝损伤增加有关。然而，最近研究表明聚酯的刺激能够诱导肝细胞坏死，这一特性可以增加血清HMGB1水平并提高RIPK3的表达水平［34］。此外，RIPK3的上调已经在人NASH和饮食性小鼠脂肪型肝炎模型中被检测到［35］。因此，坏死性凋亡机制有助于促进了NASH肝损伤。

3.4菌血症尽管菌血症是危重症患者死亡的主要原因，其病理生理学特点仍然难以捉摸。菌血症是由急性、系统免疫反应引起的多重损伤，最常见的是细菌感染，导致一连串的炎症反应事件和多器官功能衰竭［36］。大量的细胞死亡参与了多器官功能衰竭［33］。此外，脓毒症与广泛产生的反应氧（ROS）和促炎性细胞因子TNF-α具有显著的相关性。因此，由脂多糖或TNF-α诱导的动物模型常被用于模拟高度炎症反应［37］。

RIPK1/RIPK3依赖的坏死性凋亡与由TNF-α诱导的全身炎症反应综合症（SIRS）有着密切的关联［31，38］。Nec-1和Nec-1s的预处理以及RIPK3缺失均能减少强烈的细胞因子反应，降低致死率。多项研究证实，RIPK3缺失的小鼠对mTNF或mTNF/z-VAD诱导的SIRS起保护作用［39-41］。此外，RIPK1激酶的失活形式可以保护TNF-α诱导的SIRS，降低致死率，这一结果在RIPK1激酶失活的基因敲除小鼠中得到证实［39，40］。但是，在由盲肠结扎和穿刺（CLP）引起的菌血症模型中，Ripk3缺失对动物模型的保护作用存在一定的争议。有研究表明Ripk3缺失对CLP诱导的菌血症小鼠有保护作用［38］，而另一项研究显示不管是Ripk3缺失还是Mlkl缺失都可以降低CLP诱导的菌血症的死亡率［42］。

4　以坏死性凋亡为靶点的药物治疗

坏死性凋亡的关键分子RIP1、RIP3和MLKL在肝脏相关疾病中的功能和确切机制还不是很清楚。坏死性凋亡特异性抑制剂小分子Nec-1在许多肝脏相关疾病条件下的保护作用已经被报道。Nec-1是一个有效的坏死性凋亡特异性抑制剂，具体表现如下：①Nec-1可特异性抑制坏死性凋亡而不影响凋亡和细胞自噬；②Nec-l不影响正常细胞的普通生理学功能；③Nec-l抑制坏死性凋亡的特异性也经过广泛的构效关系分析而得到很好的确证；④Nec-l通过与T-环相互作用并不影响其他功能性结构域的特异性变构，而能抑制RIPl的激酶活性［12，43］。

综上所述，坏死性凋亡是一种不依赖于caspase的新型细胞死亡途径，进一步深入研究坏死性凋亡通路在不同肝脏疾病中的确切作用，不仅有利于加深对肝脏疾病发病机制的理解和认识，而且对相关肝脏疾病治疗靶点的确证以及治疗药物的研究也具有重要意义。

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（收稿：2015-12-17）

（本文编辑：陈从新）

Necroptosis and its role in hepatitis and other liver diseases

Song Jinyue，Ren Feng，Zhang Huanhu.
Department of Chinese Traditional Medicine，Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi Province，China Corresponding author:Zhang Huanhu，E-mail:zhhh31@163.com

Traditionally cell death is divided into two categories，e.g.apoptosis and necrosis.But a growing body of research results show that the necrotic apoptosis is a kind of cell death different from necrosis and apoptosis，and plays an important role in a variety of diseases.Activation of necroptosis by ligands of death receptors requires the kinase activity of RIP1，which mediates the activation of RIP3 and MLKL，two critical downstream mediators of necroptosis.Blocking the kinase activity of RIP1，a key druggable target in the necroptosis pathway，by necrostatins inhibits the activation of necroptosis and allows cell survival and proliferation in the presence of death receptor ligands.In this review，we will discuss the difference between apoptosis，necrosis and necrotizing apoptosis，and we will summarizes the mechanism by which the necrotizing apoptosis occur in liver diseases.

Hepatitis；Necroptosis；Necrosis；Apoptosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.030

国家125科技重大专项（编号：2012ZX10002004-00 6/2012ZX10004904-003-001/2013ZX10002002-006-001）；国家自然科学基金项目（编号：81270532）；北京市自然科学基金项目（编号：7162085）；首都临床特色应用研究项目（编号：Z161100000516113）；王宝恩肝纤维化研究基金项目（编号：CFHPC20131031）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划（编号：2013-3-075）

030001太原市山西医科大学第二医院中医科（宋金玥，张桓虎）；首都医科大学附属北京佑安医院（任锋）

宋金玥，女，27岁，硕士研究生。主要从事中西医结合治疗肝脏疾病研究。E-mail：863477249@qq.com

张桓虎，E-mail：zhhh31@163.com