嗜酸乳杆菌产细菌素培养条件的优化

郝 建 云，　陶 　 冶，　刘 诗 文，　肖 　 珊，　王 　 晗，　王 际 辉

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连　116034 )



嗜酸乳杆菌产细菌素培养条件的优化

郝 建 云，陶 冶，刘 诗 文，肖 珊，王 晗，王 际 辉

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:为了提高嗜酸乳杆菌产细菌素的产量，通过单因素和正交试验优化了嗜酸乳杆菌产细菌素的培养条件。采用琼脂扩散法测定含有细菌素的发酵上清液对大肠杆菌的抑菌活性，根据抑菌圈的大小，确定最适培养基成分和发酵条件。试验结果表明，嗜酸乳杆菌产细菌素最佳培养基组分为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏12.5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖15 g/L，柠檬酸氢三铵2 g/L，无水乙酸钠5 g/L，碳酸钙1 g/L，K2HPO4·3H2O 2.62 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，Tween-80 3 mL/L。最佳发酵条件为初始pH 6.3、37 ℃、接种量3%、培养时间22 h。此条件下，抑菌圈直径可达22.4 mm。

关键词:嗜酸乳杆菌；细菌素；条件优化；抑菌活性

0引言

乳酸菌是目前世界上公认安全的食品级微生物，能产生具有抑菌或杀菌效果的有机酸、过氧化氧、双乙酰和细菌素[1-2]。其中，细菌素是乳酸菌发挥益生作用的主要物质[3]。细菌素是细菌在生长过程中通过核糖体途径合成并分泌到环境中的具有抑菌作用的蛋白或多肽物质，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点[4]，产生菌对其细菌素具有自身免疫性，在抑制多种病原微生物和食物腐败菌等方面具有重要作用[5-6]。

1969年，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)联合食品添加剂专家委员会将乳酸乳球菌乳酸亚种产生的细菌素 Nisin批准为食品添加剂，细菌素受到广大科学工作者的广泛关注[7]，逐渐成为食品、医药、畜牧业、养殖业等行业的研究热点[8]。但Nisin抑菌谱较窄，只对近缘关系的革兰阳性乳酸菌和非乳酸菌有抑制作用，对革兰阴性细菌和真菌无效[9]。同时，其较低的产量也制约着细菌素的工业化生产及应用，成为细菌素商业应用的瓶颈[10-11]。

近几年研究发现，嗜酸乳杆菌产生的细菌素在抑菌方面具有广谱性，不仅可抑制革兰氏阳性菌，也可抑菌革兰阴性菌和真菌[12-13]。此外，培养基成分对细菌素的产量也有很大的影响，是菌体生长和细菌素合成的重要因素[14-15]。研究表明，培养条件的优化对于细菌素产量的提高有非常重要的影响[16-17]。

本试验以嗜酸乳杆菌为试验菌株，研究碳源、氮源种类、起始pH、培养温度等因素对嗜酸乳杆菌产细菌素的影响。通过单因素和正交试验优化嗜酸乳杆菌产细菌素的培养条件，以期了解菌株特性和提高产细菌素水平。

1试验

1.1菌株

产细菌素菌株：嗜酸乳杆菌；指示菌株：大肠杆菌，均为实验室保藏。

1.2方法

1.2.1指示菌菌悬液的制备

将3环指示菌接种于100 mL LB液体培养基，30 ℃、120 r/min摇床培养24 h，放置4 ℃冰箱备用。

1.2.2乳酸菌的培养及细菌素粗品的制备

1.2.2.1嗜酸乳杆菌种子液的制备

挑取3环已活化的嗜酸乳杆菌接种于100 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，作为种子液备用。

1.2.2.2嗜酸乳杆菌发酵上清液的制备

将种子液以2%接种量接种于100 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养24 h后，于4 ℃下8 000 r/min离心15 min，弃去沉淀，取上清液并经0.45 μm孔滤膜过滤，于4 ℃条件下保存备用。

1.2.2.3嗜酸乳杆菌细菌素粗品的制备

采用硫酸铵沉淀法，将发酵上清液用80%硫酸铵沉淀，磁力搅拌6 h后，在4 ℃下静置12 h，10 000 r/min离心20 min，取沉淀溶解于去离子水中，4 ℃下6 000 r/min离心5 min，去除不溶物，保存备用[18]。

1.2.2.4样品的预处理与浓缩

取硫酸铵沉淀样品加入截留分子质量为1 ku 的透析袋中，4 ℃条件用去离子水透析12 h以上，期间换缓冲液4次以上，用以除去小分子杂质和盐离子，将嗜酸乳杆菌细菌素透析液，分装至培养皿中(每个培养皿5 mL)，冷冻干燥至粉末，即为嗜酸乳杆菌细菌素粗样品，保存备用[19]。

1.2.3细菌素的活性评价

采用琼脂扩散法测定嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌能力[20]。取0.5 mL的指示菌菌悬液加入4.5 mL 无菌水中混匀。将指示菌稀释10，100，1 000，10 000倍，用移液枪吸取100 μL的指示菌稀释液到于平板上，用三角涂布棒涂匀。每个平板放1～3个牛津杯，然后用移液枪在牛津杯内加入80 μL透析液。37 ℃培养24 h，用直尺测量抑菌圈直径(包括牛津杯直径)。

1.2.4培养基成分的确定

1.2.4.1碳源

分别以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉4种不同的糖类为碳源进行发酵，确定最佳碳源。再添加不同质量分数的最佳碳源，确定最适宜嗜酸乳杆菌产细菌素的碳源添加量。

1.2.4.2氮源

确定最佳碳源及其添加量后，选择酵母膏作辅助氮源，分别以20%蛋白胨、20%牛肉膏、10%蛋白胨+10%牛肉膏、15%蛋白胨+5%牛肉膏、5%蛋白胨+15%牛肉膏作为氮源，确定最适宜嗜酸乳杆菌产细菌素的氮源。

1.2.4.3Tween-80用量

确定最佳氮源添加量后，选择0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的Tween-80，以确定最适宜嗜酸乳杆菌产细菌素的Tween-80添加量。

1.2.5培养基成分的正交优化

将单因素筛选出的最佳碳源、氮源、Tween-80用量按L9(34)进行正交试验，共设9个处理，每个处理3个重复。培养基成分的正交因素及水平如表1所示。

表1　培养基成分的正交试验因素水平表

1.2.6发酵条件单因素优化试验

1.2.6.1初始pH

分别配制pH为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5的培养液，确定嗜酸乳杆菌产细菌素的最适初始pH。

1.2.6.2培养温度

确定初始pH后，选择31，34，37，40，43 ℃试验，确定嗜酸乳杆菌产细菌素的最适培养温度。

1.2.6.3接种量

在确定初始pH与温度后，选择接种量为1%，2%，3%，4%，5%进行试验，确定嗜酸乳杆菌产细菌素的最佳接种量。

1.2.6.4培养时间的优化

在确定初始pH、温度与接种量后，选择培养时间为16，20，24，28，32 h进行试验，确定嗜酸乳杆菌产细菌素的最适培养时间。

1.2.7发酵条件的正交优化

根据单因素试验结果，选择初始pH、培养温度、接种量和培养时间4个因素进行正交试验。采用L9(34)正交表进行试验，共设9个处理，每个处理3个重复。各因素水平如表2所示。以上试验均设3个平行，测定指标为抑菌圈直径。

表2　发酵条件的正交试验因素水平表

2结果与讨论

2.1培养基成分的确定

2.1.1碳源

选取质量分数为2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉，研究不同碳源对嗜酸乳杆菌产细菌素的影响，结果如图1所示。从图1中可以看出，以葡萄糖作为碳源抑菌圈直径最大，达18.6 mm。因此选择葡萄糖作为嗜酸乳杆菌产细菌素的发酵碳源。

图1　不同碳源对抑菌活性的影响

确定葡萄糖作为碳源后，考察不同添加量对嗜酸乳杆菌产细菌素的影响，结果如图2所示。由图2可以看出，当葡萄糖添加量为1.5%时，嗜酸乳杆菌产细菌素的抑菌圈直径最大，达18.7 mm。

图2　葡萄糖添加量对抑菌活性的影响

2.1.2氮源

选择蛋白胨20%(A)、牛肉膏20%(B)、蛋白胨10%+牛肉膏10%(C)、蛋白胨15%+牛肉膏5%(D)、蛋白胨5%+牛肉膏15%(E)作为氮源,酵母膏为辅助氮源，考察不同氮源对抑菌活性的影响，结果如图3所示。由图3可以看出，选择10%蛋白胨+10%牛肉膏作为氮源嗜酸乳杆菌产细菌素的抑菌圈直径最大，达19.1 mm。

图3　不同氮源对抑菌活性的影响

2.1.3Tween-80用量

选择不同的Tween-80添加量，考察Tween-80用量对抑菌活性的影响，结果如图4所示。如图4所示，Tween-80添加量为0.3%时，嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌圈直径最大，达17.9 mm。

2.2培养基成分正交试验结果

由表3可知，各种因素对嗜酸乳杆菌产细菌素的影响由高到低依次为：牛肉膏(C)，葡萄糖(A)，蛋白胨(B)，Tween-80(D)。通过正交试验优化，得到嗜酸乳杆菌产细菌素最优培养基为：葡萄糖1.5%、牛肉膏1.25%、蛋白胨1.0%、Tween-80 0.3%，此时抑菌圈直径可达20.1 mm。

图4　Tween-80用量对抑菌活性的影响

表3　培养基成分的正交试验结果

2.3发酵条件单因素优化结果

2.3.1初始pH

选择优化后的发酵培养基，考察不同初始pH对抑菌活性的影响，结果如图5所示。由图5可以看出，当pH=6.5时，嗜酸乳杆菌产细菌素直径最大，可达18.9 mm。

图5　初始pH对抑菌活性的影响

2.3.2培养温度

考察不同培养温度对抑菌活性的影响，结果如图6所示。由图6可以看出，在37 ℃时，细菌素抑菌圈直径最大，达到19.3 mm，而后随着温度的升高有所下降。其原因可能是温度首先影响的各种酶的反应速率以及蛋白质的理化性质，其次影响发酵液的物理性质。

图6　温度对抑菌活性的影响

2.3.3接种量

考察不同接种量对抑菌活性的影响，结果如图7所示。当接种量为3%时，细菌素抑菌圈直径最大，达到20.2 mm。这是由于较小接种量可能使培养基营养物质不能被充分利用；而接种量过大可能会带入过多的代谢废物而不利于菌体生长并产生细菌素。

图7　接种量对抑菌活性的影响

2.3.4培养时间

考察不同培养时间抑菌活性的影响，结果如图8所示。确定24 h为最适宜嗜酸乳杆菌产细菌素的培养时间，此时细菌素抑菌圈直径增最大，达到19.6 mm。这可能是由于16～24 h菌量未达到一定数目以至于细菌素产量较低，而24 h后，不断有菌体死亡，且细菌素不断吸附于菌体导致细菌素抑菌圈直径下降。

图8　培养时间抑菌活性的影响

2.4发酵条件正交试验结果

从表4可知，各种因素对嗜酸乳杆菌产细菌素的影响由高到低依次为温度，pH，接种量，时间。通过正交试验，得到嗜酸乳杆菌产细菌素最优培养条件为pH 6.3，培养温度37 ℃，接种量3%，培养时间22 h，此时抑菌圈直径可达22.4 mm。

表4　发酵条件的正交试验结果

3结论

产细菌素最佳培养基组分为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏12.5 g/L，葡萄糖15 g/L，柠檬酸氢三铵2 g/L，无水乙酸钠5 g/L，碳酸钙1 g/L，K2HPO4·3H2O 2.62 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，Tween-80 3 mL/L。最佳发酵条件为：初始pH 6.3、37 ℃、接种量3%、培养22 h。此条件下，其抑菌圈直径可达22.4 mm，为优化前的1.2倍。

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Optimization of culture conditions for bacteriocin production byLactobacillusacidophilus

HAOJianyun,TAOYe,LIUShiwen,XIAOShan,WANGHan,WANGJihui

( School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:The medium was optimized by single factor and orthogonal test to increase the yield of Lactobacillus bacteriocin. The antibacterial activity of the supernatant against Escherichia coli. was tested with agar diffusion, and the optimal composition of culture medium was determined according to the inhibition zone, The optimal composition was peptone 10 g/L, beef extract 12.5 g/L, yeast extract 5 g/L, glucose 15 g/L, C6H17N3O72 g/L, sodium acetate 5 g/L, CaCO31 g/L, K2HPO4·3H2O 2.62 g/L, MgSO4·7H2O 0.58 g/L, MnSO4·H2O 0.25 g/L, Tween-80 3 mL/L. The optimal fermentation conditions were pH 6.3, 37 ℃, inoculation 3%, culturing time 22 h. Under the conditions, the inhibition zone diameters could reach to 22.4 mm.

Key words:bacillus acidophilus; bacteriocin; culture conditions; antibacterial activity

作者简介:郝建云(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：王际辉(1970-)，男，教授.

基金项目:国家海洋公益性行业科研专项项目(201405003)；辽宁省农业青年科技创新人才培养计划项目(2015004)；辽宁省教育厅创新团队项目(LT2014010)；大连市科技计划项目(20140072).

收稿日期:2014-12-22.

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)01-0006-05