近缘两个木薯品种块根蛋白质组比较分析

张振文,罗秀芹,林立铭,陈松笔

(中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/农业部 木薯种质资源保护与利用重点实验室,海南 儋州 571737)



近缘两个木薯品种块根蛋白质组比较分析

张振文,罗秀芹,林立铭,陈松笔*

(中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/农业部 木薯种质资源保护与利用重点实验室,海南 儋州 571737)

摘要：以木薯(ManihotesculentaCrantz)栽培种华南9号(SC9)及其近缘野生种W14的块根为研究对象,利用蛋白质组学技术,分析了这两个品种块根的蛋白质差异情况,并对差异蛋白质的功能进行了分类。结果表明：主要有22个蛋白质出现较大的差异表达,其中16个为已知功能的蛋白质,可分为7类,包括信号传导、核酸代谢和碳与能量代谢等。其中,与碳和能量代谢相关的蛋白质果胶酶，以及与光合作用相关的苹果酸合成酶在SC9块根细胞中的表达量显著高于在W14中的。进一步的RT-PCR定量分析发现PME3基因在SC9块根中的表达量显著高于在W14中的。

关键词：木薯；块根;野生种;栽培种；蛋白质组学；比较

木薯(Manihotesculenta),又称树薯,属大戟科木薯属植物,有5000多年的种植历史,遍布世界90多个国家和地区,包括非洲、拉丁美洲和东南亚国家,是世界六大粮食作物和三大薯类作物之一,是非洲及南美洲近6亿人口的主要口粮[1],其产量的变化直接关系到世界的粮食安全,特别是对世界热带、亚热带地区的国家发展具有重要的战略意义,得到普遍的关注。有关研究表明木薯鲜薯产量的潜力可达90 t/hm2左右[2-3],是目前世界木薯平均产量(12.8 t/hm2, FAO, 2012)的7倍左右,发展潜力巨大,而品种改良是提高该作物产量的主要途径之一。

随着科技的发展,木薯品种改良和育种技术日新月异,木薯产量也不断提高,这得益于新品种的推广应用,而新品种是以丰富的种质资源作为物质基础的[4]。研究表明木薯起源于中美洲,并从许多野生木薯种中驯化出野生亚种、野生近缘种和栽培种木薯[5-6]；这些种质资源在抗逆、耐贮藏和高淀粉等生理、生化特性和农艺特征方面有不同的表现[7-11]；种质间的这种差异在蛋白质的表达中可以得到验证[12-14]。于是,比较野生近缘种木薯块根与栽培种木薯块根主要差异蛋白质的表达,可以更好地解释品种间的性状差异,这对探索新基因或新蛋白质的新功能具有重要的实践意义。

本研究对淀粉含量低的野生近缘木薯品种和淀粉含量高的栽培木薯品种的块根蛋白质进行了比较,分析了野生近缘木薯品种间主要差异蛋白质的表达情况,探讨了主要差异蛋白质的表达与光合特性的相关性,旨在为木薯新品种的选育提供理论支撑。

1材料与方法

1.1实验材料

本实验所用的材料为野生型木薯W14 (Manihot

esculentassp.flabellifolia)和栽培种木薯华南9号(ManihotesculentaCrantz, SC9)(如图1)。实验材料均来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部木薯种质资源圃,种植时间为10个月。

1.2实验方法

本实验采样、取样及对蛋白质的提取、分离和鉴定均参照张振文[15]的方法进行。

1.3双向电泳凝胶分析

利用Delta 2D(4.1)软件对双向电泳凝胶进行比较、分析。

1.4蛋白质质谱鉴定

对差异蛋白质的鉴定采用德国Bruker公司生产的基质辅助激光电离解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-TOF-MS/MS)。鉴定过程分为蛋白质点胰酶酶解、质谱检测分析和肽段比对等3个过程,具体操作参照张振文[15]的方法进行。

1.5蛋白质定量分析

根据蛋白质鉴定结果,利用TransGen Biotech公司的试剂盒TransStart®Top Green qPCR SuperMix提取RNA;利用引物合成软件,设计Pectinesterase 3 OS=CitrussinensisPE=1 SV=1蛋白质相应的RNA保守序列,并委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,结果如下:

5-GTGACCTTGATTGGCACCTG-3

5-CTCGACGAGTGGTTTCACGA-3

5-ATGAGAAACCCACGATTCAG-3

5-TTAGCTGCCCTGTGTTGGAC-3

在Eppendorf Mastercycler®nexus X4定量PCR仪上进行扩增。反应体系如表1。

2结果与分析

2.1蛋白质双向电泳分离检测结果与分析

利用双向电泳(2D)分离技术,对W14和SC9木薯块根的蛋白质进行分离,并利用考马斯亮蓝G250染色3 d,经扫描后结果如图2所示。

利用Delta 2D(4.1)软件对蛋白质点进行检测分析,其中在W14中共检测到有效蛋白质点426±40个,在SC9中共检测到有效蛋白质点451±42个。以W14为对照,对检测到的蛋白质点进行比对分析,其相对体积分数比对结果如图3所示。

2.2差异表达蛋白质的分析

利用Delta -2D软件对SC9和W14木薯块根的蛋白质进行差异表达分析,结果发现主要差异表达的蛋白质点有21个(如图4)；对20个差异表达的蛋白质的3D图进行比较，结果如图5所示。

2.3差异表达蛋白质的质谱分析

利用MALDI-TOF-TOF/MS/MS测序技术,对差异表达的蛋白质点进行质谱分析,并通过Matrix Science网站(http://www. matrixscience.com)提供的Mascot软件查询比对分析21个差异蛋白质的肽质量指纹图谱(PMF),其中检索条件：对PI和MW未做要求；肽片段最大允许误差为0～2 Da (1 Da=1 u)；蛋白质分类种属选择“Green Plant”；允许漏切位点1个。进行碘乙酰胺处理,分别在SwissProt、NCBI和MSDB数据库进行检索,结果如表2。

在这22个被鉴定的差异表达蛋白质中,有16个蛋白质的功能是已知的,可分为七大类,主要包括信号传导、核酸代谢和碳与能量代谢等相关的蛋白质(见图6)。

2.4蛋白质的定量分析

果胶甲酯酶(PME)是一种重要的果胶酶,普遍存在于高等植物根、茎、叶和果实细胞中,主要对植物细胞壁和细胞之间的果胶含量进行内源调控[16-18]。本研究发现,PME3在SC9木薯块根中的表达水平是W14中的3.49倍,差异十分显著(图7)。这一结果与蛋白质的表达量基本吻合。

3结论与讨论

从抗性来讲,在木薯栽培种间块根的次生和初生结构并无显著差异,但野生种木薯块根的内皮层细胞壁比栽培种的厚,这有利于内皮层的凯氏带防止水分散失；同时野生种的维管束较大,从而使野生种比栽培种更为耐旱[14,19]。在植物细胞壁结构降解中的主要酶类包括多聚半乳糖苷酶(PG)、β-半乳糖苷酶、果胶酯酶(PME)、纤维素酶(Cellulose)、木葡聚糖内糖基转移酶(XET)等。大多数研究认为,细胞壁结构的被破坏主要由降解细胞壁的相关酶所导致[20],其中以果胶酯酶(PME)和多聚半乳糖苷酶(PG)为关键酶。本研究发现,果胶甲酯酶有3种，即PME1、PME2和PME3,它们在不同的条件下由不同的基因表达,受环境温度的影响,其中在常温下PME3的表达量呈先增强再降低的趋势,热稳定性差,在植物细胞壁降解过程中具有重要作用[18,21-26]。本研究同样发现,两个木薯品种采后块根的果胶(甲)酯酶(Pectinesterase 3 OS=CitrussinensisPE=1 SV=1)的表达水平差异显著,其在SC9块根细胞中的表达水平远远高于在野生近缘种W14中的,导致细胞容易被降解,这可能就是W14的细胞壁比SC9厚的主要原因。

有研究表明野生近缘类型的木薯品种W14和栽培种Arg7的叶片均有明显的栅栏组织和海绵组织,这是光合C3植物的主要特征,但Arg7叶片的维管束鞘细胞比W14的发达[28]。与C3植物不同,维管束鞘细胞是C4植物光合产物的主要合成场所,也是块根贮藏淀粉的主要库源,叶片光合产物的淀粉和可溶性糖(包括蔗糖)95%以上在维管束鞘细胞中[29],并伴随有生理生化过程和基因定量表达等方面的差异[30]。本研究表明,差异表达蛋白质中与光合作用相关的两个蛋白质点17(RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplastic)和21(Maturase K OS=ChiococcaalbaGN=matK PE=3 SV=1)均出现明显的差异表达,其中这两个蛋白质在栽培品种SC9中的表达比在近缘种W14中的表达高,可能是部分酶基因在这两个木薯类型中存在表达水平差异[27],而这种差异也在其他与代谢相关的蛋白质中出现，特别是在与碳代谢相关的3个蛋白质中,分别是Pectinesterase 3 OS=CitrussinensisPE=1 SV=1、Malate synthase, glyoxysomal [Triticumurartu]和ATP synthase subunit beta, mitochondrial; Flags: Precursor。其中在SC9块根中的苹果酸合成酶的表达水平显著高于在W14中的,再次说明了W14在维管束鞘细胞合成的淀粉显著少于SC9。然而,本文的研究对象是木薯块根,却在块根中发现与光合作用和淀粉代谢相关的酶,这可能是因为在木薯植株的营养器官中均存在与淀粉代谢相关的酶类,其表达水平的差异导致块根淀粉含量的差异。

本研究还发现,在22个差异表达蛋白质中,与信号传导相关的蛋白质有4个,分别是Cysteine/Histidine-rich C1 domain family protein [Arabidopsisthaliana]、EF-hand, calcium binding motif-containing protein [Arabidopsisthaliana]、Dynamin-related protein 1B OS=ArabidopsisthalianaGN=DRP1B PE=2 SV=1和Calcium-dependent protein kinase (EC 2.7.1.-) CDPK-pumpkin。这些与信号传导相关的蛋白质是如何协调和传导与植物碳代谢相关酶的代谢的,有待进一步研究。

致谢：衷心感谢江苏大学生命科学院李军老师在蛋白质质谱鉴定实验中给予大力支持与帮助！

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(责任编辑:黄荣华)

Comparative Analysis of Proteomics in Tuberous Roots between Two Kindred Cassava Varieties

ZHANG Zhen-wen, LOU Xiu-qing, LIN Li-ming, CHEN Song-bi*

(Tropical Crop Genetic Resources Research Institute, China Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Conservation and Utilization of Cassava Genetic Resources, Ministry of Agriculture, Danzhou 571737, China)

Abstract：Using cultivar species (ManihotesculentaCrantz CV. South China 9, SC9) and wild species (Manihotesculentasubsp.flabellifolia, W14 ) as material to analyze their differences by comparative proteomics. The results showed that there were 22 proteins, which should be clustered seven types among 16 proteins that function was known, including signal transfer, RNA or DNA synthesis, carbon or energy metabolism, photosynthesis, chaperones, anti-oxidation and proteins synthesis. The expression level of Pectinesterase 3 (PME3) and Malate synthase were significant higher in the root cells of SC9 than that of in W14. The relative expression level of PME3 in the root cells of SC9 was higher than that of in W14 by RT-PCR quantitative analysis.

Key words：Cassava; Tuberous root;Manihotesculentasubsp.flabellifolia; Proteomics; Comparison

收稿日期：2015-10-12

基金项目：国家自然科学基金项目(31371684);现代农业产业技术体系(CARS-12);中央及地方基本科研业务费专项(1630032012013)。

作者简介：张振文(1975─),男,福建诏安人,副研究员,博士,研究方向:木薯采后生理及蛋白质组学。*通讯作者:陈松笔。

中图分类号：S533.01

文献标志码：A

文章编号：1001-8581(2016)05-0001-06