水产动物益生菌的筛选及应用

2016-03-28韩卓然孙敬锋

水产科学 2016年1期

关键词：益生菌水产病原菌

韩卓然，孙敬锋

( 天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384 )

水产动物益生菌的筛选及应用

韩卓然，孙敬锋

( 天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384 )

水产动物；益生菌；筛选；应用

随着水产养殖业的发展和养殖强度的增加，水产动物病害爆发频繁。传统的抗生素药物虽然对治疗疾病有积极效用，但长期使用会产生巨大的负面效应：病原菌产生耐药性，效力下降[1]；药物残留干扰水产动物肠道内有益微生物菌群的生长和繁殖，影响水产动物的健康；残留在水体中的抗生素破坏养殖生态环境，水产品质量下降。近年来，我国水产品因药物残留而出口受阻的事件屡见不鲜，给我国水产业造成巨大损失。

1974年Parker[2]首创益生菌一词，最早提出益生菌有利于肠道微生态平衡。目前普遍认为，益生菌的作用主要是改善动物新陈代谢、提高营养物质吸收利用率和免疫力、减少环境污染等[3]。益生菌因具有无毒、无残留、无抗药性、无污染等特点，逐渐被广泛应用。

1 益生菌的作用机理

1.1 竞争抑制

益生菌菌群与病原菌竞争黏膜附着位点和营养方式，降低病原菌活性，阻止病原菌黏附，使养殖动物获得稳定适宜的微生物环境[4]。

1.1.1 竞争黏附位点

益生菌黏附定殖于宿主体内是发挥作用的前提。益生菌进入机体后，最先发挥的作用就是与病原菌竞争附着位点[5]。有研究表明，黏附力强的植物乳酸菌ST-Ⅲ(LactobacillusplantarumCGMCC)与致病菌共同作用于肠细胞时，通过竞争性占位效应形成生物膜，抑制致病菌的黏附和侵入，保护了细胞膜的完整性，使宿主细胞免受损伤[6]。益生菌和病原菌的黏附机制相似，益生菌分泌一种以蛋白为主要成分的黏附素，介导其黏附至肠黏膜上皮细胞，所以益生菌易于与病原菌竞争附着位点。但宿主体内毒力因子过多，机体产生的免疫应答反应过强，益生菌就会无法黏附。

1.1.2 竞争营养物质

益生菌与异养型细菌争夺肠道内有限的底物，使病原菌因缺乏营养而在竞争中不占优势。研究证明，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)与杀鲑气单胞菌(Aeromonassalraonicida)竞争游离铁离子，抑制后者的增殖[7]。大部分微生物生长均需要铁离子[8]，所以益生菌对铁离子的竞争力可作为衡量其效果的标准之一。Neeser等[9]还研究证明，益生菌在肠内与致病菌争夺碳水化合物。好氧的芽孢杆菌(Bacillus)在肠道内可消耗分子氧，制造厌氧环境，抑制好氧的致病菌，利于厌氧的乳酸菌和双歧杆菌(Bifidobacterium)的生存与增殖[10]。

1.2 分泌抑制物

益生菌可以释放细菌素、亲铁元素、溶菌酶、蛋白酶、过氧化氢等多种物质，这些物质都可不同程度地抑制各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。已证实乳酸菌产生的抑菌素可抑制其他病原菌[11]。黄沧海等[12]研究发现，乳酸杆菌代谢产物中的乳酸不是唯一起抑菌或灭菌作用的代谢物；乳酸杆菌的菌体及其代谢产物对大肠杆菌(Escherichiacoli)具有一定的协同抑制作用，且抑菌效果更好、时间更持久。李海兵[13]从健康对虾肠道内筛选出了需钠弧菌(Vibrionatriegens)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)。体外拮抗试验表明，它们对哈维氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等几种海洋水产动物的主要致病菌均有不同的抑制作用。抑制反应动力学试验表明，这些菌的代谢产物中含有抑菌活性物质。单晓枫[14]从鲤鱼(Cyprinuscarpio)肠黏膜筛选出了有抑菌作用的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，培养物上清液中含有机酸和对胰蛋白酶敏感的某种抑菌物质。

1.3 提供营养促进机体消化吸收

益生菌可以产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等胞外酶，它们不仅可以提高消化速率，还可以提供维生素、氨基酸、脂肪酸这类生长因子[15]。Bairagi等[16]报道，分离自鲶鱼(Silurusasotus)消化道的菌株可产生胞外淀粉酶和蛋白酶，促进了消化，提高了饲料的利用率。Fang等[17]研究表明，白鲟(Psephuyrusgladius)喂食含乳酸菌、纳豆杆菌(B.natto)等益生菌的饲料后，胃中酸性蛋白酶及碱性蛋白酶的活性明显提高。但应注意的是，不同属的益生菌分泌的消化酶种类和数量不同，产淀粉酶的细菌适用于草食性鱼类，而产脂肪酶能力强的益生菌适于肉食性鱼类。所以，应根据水产动物种类选择合适的益生菌[18]。

肠道是吸收营养的重要部位，益生菌可以改变肠黏膜结构，增加营养物质的吸收利用率，还可以调节肠道内pH值，影响肠道内消化酶活性，提高鱼类消化能力。Fang等[17]报道，匙吻鲟(Polyodonspathula)饲喂益生菌后，前肠肠壁和肌肉层厚度增加，前肠、中肠褶皱明显增多，消化吸收率明显提高。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)使肠道绒毛高度以及肠道上皮细胞微绒毛高度显著增加，肠吸收面积增大，吸收效率提高[19]。益生菌可以增加肠道内短链脂肪酸的含有量，且短链脂肪酸除了可以促进肠蠕动，降低食糜对机体的损伤外，还可以降低肠道内的pH值[19-20]。梅景良等[21]提取了黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)胃、肠、肝胰脏内的酶，发现只有在一定的pH内酶才具有活性。

1.4 增强非特异性免疫力

益生菌不仅可以刺激胸腺和脾等免疫器官发育，激发机体体液和细胞免疫[22]，还可以增强水产动物非特异性免疫力。幼鱼、虾和其他无脊椎动物的免疫系统发育不及成体，主要依赖非特异性免疫反应。

1.4.1 提高酶活力

溶菌酶存在于鱼体表黏液、血浆和肝脏中，可破坏病原菌细胞壁，这使鱼体表黏液成为保护鱼类的天然屏障。Taoka等[23]用含乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、丁酸梭菌和酵母菌的复合益生菌饲喂牙鲆(Paralichthysolivaceus)，牙鲆体表黏液和血浆中的溶菌酶活性及血浆蛋白含量均有所提高。孟小亮[24]给黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)投喂地衣芽抱杆菌(B.licheniformis)后，黄颡鱼血清内的白细胞吞噬活性和溶菌酶活性明显提高、谷丙转氨酶活性降低，而总蛋白含量有所增加。结果表明，应用地衣芽抱杆菌增强了黄颡鱼的非特异性免疫力，也在一定程度上改善了肝脏功能。

1.4.2 提高肠道黏膜屏障功能

肠道黏膜屏障包括微生物屏障、化学屏障、免疫屏障和机械屏障，其中机械屏障最为重要。机械屏障由肠上皮细胞和上皮细胞分泌的黏液组成，杯状细胞分泌黏蛋白遍布整个肠道，形成一层黏液层。黏液层能够保护肠道上皮细胞免受病原菌侵袭，成了肠道黏膜屏障的第一道防线。益生菌可以增加黏蛋白的分泌量，强化肠道黏膜屏障的防御能力。化学屏障由肠道中的胃酸、溶菌酶、胆汁等生物因子构成。凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei) 摄食添加益生菌的饲料时，肠道蛋白酶、淀粉酶活性增高，酶活性与生长速度具一定相关性[25]。生物屏障由肠道内菌群与肠道黏膜结合或黏附形成，益生菌可以增殖有益菌，抑制有害菌，使肠道菌群保持稳定。免疫屏障是免疫细胞、免疫分子、免疫组织和免疫器官构成的生理性屏障，具有防御病原微生物感染的作用。

1.4.3 参与其他免疫调控

益生菌在肠道中还有其他免疫调控效应，包括增强树突细胞和T细胞免疫功能，阻止致炎性细胞因子的合成及增强自然杀伤细胞的作用[26]、分泌抑菌因子及使上皮细胞紧密连接等。

2 益生菌的筛选

尽管有陆生动物益生菌用于水产养殖的报道，但从宿主本身筛选出的土著微生物可以很好地适应环境，更高效的抑制病原菌[27]。而那些非分离自鱼类消化道的益生菌株，往往不能稳定地定殖在鱼类消化道中。除了考虑益生菌在肠道内定殖以及定殖的时间外，还应注意其耐酸、耐盐、耐热等特性，这些因素均会影响益生菌的活性及作用效果。所以，筛选的益生菌应具有如下特点:(1)在低pH值和胆汁中可以存活，可在肠内定殖，竞争优势强；(2)易于获得，在体内易繁殖，体外易培养，不与病原菌杂交；(3)产生的抑菌物质对机体本身没有危害；(4)能够提高机体免疫力；(5)经高热加工后，益生菌活性好，稳定性高；(6)不带耐药因子或所含耐药因子少。根据上述特点，为保证其应用的安全性及其良好效果，目前筛选益生菌时普遍遵循以下过程。

2.1 候选菌株的获得

筛选优良菌株是使益生菌发挥良好作用的基础，在筛选过程中主要考虑合适的培养基、培养条件及尽可能从肠道中获得更多的菌株。所以获得大量候选菌株是一项十分繁重的任务。可从幼鱼和甲壳类动物消化道中分离得到固有微生物，黏附在上皮细胞的益生菌；再从黏附于黏液上的微生物中或消化道短暂定居的微生物中分离出来[28]。

2.2 益生菌的筛选

从大量候选菌株中筛选出益生菌菌种是至关重要的环节。以对病原菌的拮抗作用，对酸、胆盐和热的耐受性，以及在肠道中的黏附能力等为筛选指标，筛选出目标菌株。

2.2.1 体外拮抗试验

动物肠道内的固有菌群对外来菌群有显著的拮抗作用。体外拮抗试验是筛选益生菌的主要方法，绝大多数益生菌的筛选都是以抑制特定病原菌为目的，即在固体培养基上根据抑制物和含铁细胞的产生或对养分的竞争，筛选出益生菌[29]。目前研究者应用不同的方法进行体外拮抗试验。张玲[30]用十字交叉法，以哈维氏弧菌和副溶血弧菌作为指示菌，利用体外拮抗试验筛选出了嗜盐单胞菌属(Halomonas)；张棋[31]利用牛津杯抑菌试验进行复筛；王福强[32]以弧菌为指示菌，先后运用了点种法、上清液法和共培养法进行抑菌试验；李海兵[13]采用琼脂扩散法从健康中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)及凡纳滨对虾肠道分离出了对病原弧菌具有拮抗作用的候选菌，并进行了体外拮抗试验。曾东[33]采用双层平板法测定分离菌株对病原菌的拮抗作用。

2.2.2 菌株耐受性

2.2.3 菌株的鉴定

传统的鉴定菌株方法通常是参考细菌鉴定手册，综合考虑菌株耐受性，结合形态观察、革兰氏染色、测定各项生理生化指标和血清学反应等。目前分子生物学方法也普遍应用于细菌鉴定过程中，如指纹图谱技术、基因组探针技术、基因测序、GC含量测定和聚合酶链式反应等。近年来，自动微生物鉴定系统因其高效、简便，准确等特点也逐渐被广泛应用[36-38]。此外，也有将光学手段应用到益生菌的鉴定工作中，如荧光光谱、红外光谱技术等[39-41]。

2.2.4 安全性鉴定

虽然对益生菌安全性并无公认的解释，但综合目前对益生菌安全性的研究可以获得如下的认识:益生菌一定不能是致病菌，且不能产生有害物质，菌株不能通过遗传修饰获得有害基因或者具有将有害基因或耐药性因子转移的潜力。所以，试验筛选出的益生菌还需在活体中检测，包括向宿主动物体内引入候选菌种，监测记录生长状况、种群分布、残留量和各种理化指标等，确保该菌种对宿主无害。最后还要确保益生菌在正常条件下可稳定增长。

2.3 体内作用效果评价

严格按照以上步骤筛选出的菌株，具有如下特点：(1)在体外能够拮抗病原菌；(2)对不良环境具有耐受性；(3)对宿主没有致病性。评价这些候选菌株在鱼体内或水体中的应用效果，是筛选优良菌株的最后关键性一步，即从候选菌株中继续筛选能够抵抗病原体攻击(通常需要攻毒试验来确定)、具有免疫增强作用或明显改善水质的菌株。Burbank等[42]从虹鳟(Oncorhynchusmykiss)肠道中筛选出了可抑制嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)的益生菌，体外试验结果表明，有16株菌株具有可抑制或降低嗜冷性黄杆菌致病性的潜在能力，被作为候选益生菌。Burbank等[43]从上述16株候选益生菌菌株中挑选10株进行饲喂试验。结果表明，有两株 (C6-6和C6-8)可显著降低感染了嗜冷黄杆菌的虹鳟的死亡率。这两株菌株最终可以从胃肠道中再次被分离出来，表明其在肠道内定殖的能力。

3 益生菌在水产养殖中的应用

益生菌应用于水产养殖的方式有多种，如注射或浸浴生物体[44-45]、作用于养殖水体和作为饲料添加剂等。目前，将益生菌直接应用于养殖水体和作为饲料添加剂的方法因安全、见效快等优势被普遍使用。

3.1 直接应用于养殖水体

在养殖水体中使用益生菌，可以改善养殖水体的水质，促进水产动物生长[46]。赵玉洁等[47]报道，光合细菌能将水域中异养菌分解的残余有机物产生的有机酸、硫化氢及氨等作为基质，合成菌体物质并增殖，既参与水质净化，又可被其他动物所捕食。张小平[48]在养殖水体中添加枯草芽孢杆菌SC02及与假单胞菌的复合菌剂，在一定时间内能有效去除养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮和总氮等的含量。张信娣等[49]将红假单胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)应用于三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)养殖水体，可稳定水体pH，去除含氮化合物，降低化学需氧量，促进水体氮循环。宋协法等[50]在养殖半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)稚鱼的水体中添加以芽孢杆菌为主要成分的益生菌干粉后，稚鱼的肥满度和成活率分别提高了5.29%～5.41%和5.10%～5.67%。

益生菌自身繁殖分解了大量的有机物，为有益藻类提供了营养，促进了浮游动物的生长，维持了生态系统平衡。养殖水体中的残饵和粪便使大量有机物积聚在池塘淤泥中，大量繁殖异养有害菌，污染水质，消耗氧气。加入益生菌可减少微生物耗氧量，改变水体和底泥的微生物组成和结构。Devaraja等[51]向虾池中投入了以芽孢杆菌为主的复合微生物制剂后，水体沉积物好养菌的数量增加，有害弧菌的数量降低，加速了水体中有机物的降解，改善了养殖生态环境。

3.2 水产动物饵料添加剂

益生菌可以改善饲料品质，提高饲料营养，增强水产动物对饲料的吸收利用率，降低发病率，促进生长，提高幼苗成活率，改善水产品品相及口感。Mirbakhsh等[52]在虾苗培养中使用枯草芽孢杆菌SI02和花域枯草芽孢杆菌IS03(B.vallismortisIS03)，提高了幼苗的生长率及成活率。覃初斌[53]等研究发现，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus) CCICC6141和干酪乳杆菌(L.casei) BL23可以刺激斑马鱼(Daniorerio)卵母细胞的成熟，提高繁殖力以及胚胎质量。Burbank等[42]发现，芽孢杆菌可以提高稚参变态率；张汉华等[54]在斑节对虾(Penaeusmonodon)养殖水体中添加益生菌制剂后发现，斑节对虾性状改善明显，规格变大、活力变强、大小均匀、产量提高、饲料系数降低；孟小亮[24]对黄颡鱼投喂地衣芽孢杆菌后，降低了鱼体肌肉脂肪含量，增加肌肉粗蛋白以及风味氨基酸含量，使鱼肉鲜美适口，提高了水产品营养价值和经济价值。

很多研究表明，同种鱼饲喂单一益生菌和复合益生菌的效果不同。潘雷[55]发现，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)摄食添加含地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳酸菌(L.acidophilus)以及双歧杆菌(Bifidobacterium)的复合益生菌的饲料后，存活率显著提高。胡毅等[25]将3种菌株分别或组合为不同的复合益生菌加入饲料中，发现饲喂复合益生菌组的凡纳滨对虾的淀粉酶活力、血清蛋白浓度及溶菌酶活力明显高于单一菌株组。但曾东[33]却发现，复合菌的效果不一定优于单一菌，单一枯草芽孢杆菌菌剂的作用效果优于枯草芽孢杆菌与光合细菌复合菌剂和枯草芽孢杆菌与肠球菌复合菌剂。

4 展望

益生菌为无毒、无残留、无副作用的微生物制品，在水产养殖中逐渐广泛应用，但水产动物益生菌的研究及应用依旧存在很多不足。首先，对益生菌抑制病原菌作用机理的研究都是在体外条件下进行，而在体内的作用机制是否与体外相同尚不清楚。益生菌与致病菌竞争营养物质的种类和过程也不明确；其次，水产养殖中使用很多益生菌并不是从水产动物或者生活环境中筛选出来，而是来自某些陆生动物，这就造成益生菌株无法定殖或不稳定、效果不佳；第三，同一株菌在不同水生动物体内的作用效果、复合菌株与单一益菌株的益生效果、不同复合菌株最佳配伍都尚不清楚；最后，益生菌在宿主体内是否会过量繁殖或突变、是否会对宿主产生不利影响、直接将益生菌添加到养殖水体中是否会破坏生态平衡等问题也亟待研究。

尽管益生菌在应用中遇到诸多问题，但是随着人们对水产品安全和品质的要求不断提高，以及水产养殖疾病问题日益突出，益生菌成了可以替代抗生素及化学药品，防止水产动物病害的最佳选择，所以必须加强水产动物益生菌筛选和应用研究。第一，加强对已有益生菌菌种添加量、添加剂型、添加频率、安全性和药品配伍等问题的研究；第二，不断加强针对特异性病原的开发和应用的研究，不断丰富水生动物益生菌资源。第三，加强基础理论研究，主要针对益生菌在体内的增殖特点、作用机理及与免疫力的相互关系等研究，以期为水产动物益生菌的筛选及应用提供科学的理论依据。

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Screening and Application of Probiotics in Aquaculture

HAN Zhuoran, SUN Jingfeng

(Tianjin Key Lab of Aqua-ecology and Aquaculture, Department of Fishery Science,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

aquatic animal; probiotics; screening; application

S917.4

1003-1111(2016)01-0093-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.017

2015-06-01；

2015-08-31.