荞麦蛋白肽研究进展及展望

郭 洪，李云龙

（山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原 030031）

荞麦蛋白肽研究进展及展望

郭 洪，*李云龙

（山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原 030031）

荞麦是一种集营养与保健为一体的粮食作物，营养丰富、蛋白质含量较高，是优良的荞麦蛋白肽来源。通过综述国内外近年来对荞麦活性肽的制备、分离纯化、结构鉴定和生物活性的研究，展望了荞麦活性肽的应用前景，以期为荞麦活性肽的研发和利用提供参考。

荞麦；蛋白肽；生物活性

荞麦在世界范围内广泛种植，特别是中国、俄罗斯及欧洲等地的冷凉高原和山区，甜荞和苦荞是常见的品种，其功能成分包括蛋白质、黄酮类、D-手性肌醇等。其中，荞麦蛋白质中氨基酸种类全面、配比得当，尤其富含赖氨酸、精氨酸等必需氨基酸成分，营养价值与鸡蛋、牛奶等相当，具有多种生理保健活性。研究表明，荞麦蛋白对多种慢性病有治疗功效，特别是高血压、高血脂、高血糖和肥胖等。荞麦蛋白肽具有比荞麦蛋白更好的理化性质，如对热稳定、无免疫原性，可由肠道直接吸收，且速度快、吸收率高。通过降解制备的荞麦多肽具有抗氧化活性、抗衰老和抗疲劳、调节血脂和血糖、抑制脂肪蓄积、抑制胆结石以及抗肿瘤等生物学功效。深入研究荞麦蛋白水解特性及其水解物中小分子肽的功能活性，对于开发新的具有特殊生物活性的小分子活性肽产品、有效利用荞麦蛋白资源、扩大荞麦蛋白的应用领域均具有重要作用。

1 荞麦蛋白活性肽制备方法

生物活性肽是蛋白质经过特征酶降解后产生的具有显著生物学活性的数个氨基酸组成的肽类混合物，具有多种人体代谢和生理调节功能[1]。生物活性肽的制备方法和途径主要有3种[2-5]：①从自然界的生物体中提取天然活性肽类；②采用合成的方法制备生物活性肽；③通过蛋白酶水解获得活性肽。生物体内的生物活性肽含量低，直接提取成本很高，残存的溶剂具有毒性；化学合成试剂价格高，常用于合成附加值高、中等长度的医药用肽[6]；蛋白酶水解法条件温和，且没有有毒化学品的残留，在实践中得到了广泛的应用。

早在1993年，日本学者利用一系列蛋白酶水解荞麦蛋白质，得到一种结构与响尾蛇毒素十分相似的三肽，可显著抑制血管紧张素转化酶的活性，而使血压下降[7]。目前，对酶解的系统性研究还很欠缺。崔霞等人[8]研究了2种蛋白酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶）水解苦荞麦蛋白制备生物活性肽，发现碱性蛋白酶的水解效果较好，并最终确定了碱性蛋白酶水解苦荞蛋白的最佳工艺条件。李红敏等人[9]利用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶分别水解苦荞蛋白复合物，对各种酶的水解条件进行了优化，并比较了酶解液的抗氧化性，研究发现制备荞麦多肽的适宜酶为碱性蛋白酶，而复合蛋白酶水解得到的水解产物抗氧化性最强。丰凡[10]利用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶分别水解荞麦制备荞麦多肽，并且得到了最佳工艺条件。田斌等人[11]采用中性蛋白酶对荞麦蛋白进行水解，得出最佳酶解条件为加酶量5 000 U/g，底物质量浓度40 g/mL，温度50℃，pH值7.5，酶解时间2 h。Tang C H等人[12]将荞麦蛋白进行酶解处理后，研究了其水解产物的抗氧化活性，发现荞麦多肽有极强的抗氧化活性，能有效抑制亚油酸过氧化。王兴等人[13]通过体外模拟部分胃肠道消化过程，结果显示经模拟消化10 h产生的多肽抗氧化活性强，经电泳分离显示抗氧化活性最强的多肽分子量是900 Da。

2 荞麦蛋白肽分离纯化及鉴定方法

2.1 超滤法

超滤是一种有效的物理分离方法，能够将溶液净化、分离或者浓缩，对于生物活性大分子、蛋白质、DNA、高分子化合物等具有很强的分离能力，其高效、节能的优点已被广大生产者所认同。其常用的操作模式是将将底物通过使用不同截留分子质量的超滤膜进行产物分级，并研究分离产物的功能性。

在超滤技术分级分离的过程中发现，由于溶质在膜面析出，造成膜的不可逆污染以及浓差极化过大，最终使蛋白质损失，成为制约超滤技术应用的关键因素，采用搅拌和旋转膜相结合的模式可有效缓解上述现象。此外，溶液的pH值也会影响渗透通量（Permeate flux），研究发现在pH值为7时可获得最大的渗透通量，等电点时渗透通量最低。

2.2 柱层析

柱层析是最近几十年来发展很快的高效分析分离技术。可以根据各种层析技术的原理，选用一种或几种方法进行荞麦肽的纯化。用于荞麦肽分离凝胶层析的型号主要有SephadexG-15，SephadexG-25，Bio-Gel P2。邢健等人[14]采用超高压液相色谱（UPLC），通过线性梯度洗脱，从众多组分中分离出单一的短肽成分。Christa K等人[15]采用柱前衍生反相高效液相色谱（RP-HPLC）对多酶复合水解后荞麦蛋白肽进行分离分析，确定了一系列具有显著清除DPPH自由基能力的氨基酸序列片段。

2.3 鉴定方法

多肽的分析检测主要是通过色谱分离技术（如柱层析、HPLC分离纯化、毛细管电色谱）和毛细管电泳技术将多肽分离纯化后进行检测研究，检测手段包括柱前衍生反相高效液相色谱（RP-HPLC）、毛细管电泳质谱（CE-MS）分析等。近年来，随着分析仪器技术的进步，快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）、基质辅助的激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等都已经应用于蛋白质多肽的检测中。Ma Y等人[16]采用碱抽提和等电点沉淀法提取荞麦蛋白后，用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化得到单一多肽，并用质谱串联（MS-MS）进行了定性分析。

3 荞麦蛋白肽生物活性

3.1 抑菌作用

国外学者已经从荞麦中获得了有抑菌作用的活性肽。荞麦抑菌肽存在于荞麦的种子、麸皮和皮壳中，具有广谱抑菌效应。Thomma B P等人[17]的研究表明，植物抑菌肽大多具有45～54个氨基酸残基且由4个二硫键连接。Fujimura M等人[18]从荞麦中分离到2种抑菌肽，命名为Fa-AMP1和Fa-AMP2，均由4个二硫键连接的40个氨基酸残基构成。植物抑菌肽在二级结构上由3段反平行的β折叠和1个α螺旋组成，这与人体防御素、昆虫防御素相似。结构的相似性决定生理功能相似。抑菌肽通过将α螺旋插入微生物细胞膜，造成膜表面渗漏缺陷而杀死病原菌[17]。Fujimura M等人[18]的研究结果显示，Fa-AMP1和Fa-AMP2对革兰氏阳性菌-密西根棒形杆菌（Clavibacter michiganesis）和萎蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens），革兰氏阴性菌-软腐病（Erwinia cartovora）、放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter） 和毛根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 以及真菌-尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum） 和白地霉菌（Gotrichum candidum） 都表现出抑制其增殖生长和广谱抗菌的特性。

3.2 胰蛋白酶抑制作用

荞麦蛋白的氨基酸种类全面、配比得当，具有很高的营养价值，然而由于蛋白酶抑制因子、单宁和膳食纤维等抗营养因子的存在，降低了其在胃肠道中的利用率。Kiyohara T等人[19]的研究指出，荞麦胰蛋白酶抑制剂分为2类，即稳定性抑制菌和暂时性抑制菌。前者由51～67个氨基酸残基构成，在N-末端存在亮氨酸残基；而后者由85～99个氨基酸残基构成，在N-末端存在丝氨酸残基。Oparin P B等人[20]的研究说明，胰蛋白酶抑制剂分子内存在的二硫键对于其功能是必不可少的。胰蛋白酶抑制剂在经过离子交换色谱后分为阳离子和阴离子，均表现出对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制效应，这也解释了荞麦食品在胃肠道中消化率较低的原因。除了抗营养效应外，荞麦蛋白抑制剂还表现出对艾滋病病毒逆转录酶和癌细胞的抑制效应。

3.3 抗肿瘤作用

研究表明，荞麦中含有的胰蛋白酶抑制剂通过降低组织器官周边的蛋白酶活性达到抑制癌变细胞扩散，从而实现抗肿瘤效果。Park S S等人[21]的研究认为，BWI-1和BWI-2a能够抑制人类T细胞型白血病细胞群的活性，并且能够激活细胞程序性死亡的DNA序列使得肿瘤细胞凋亡。通过MTT比色法和流式细胞仪法分析，重组荞麦蛋白抑制剂能够抑制IM-9细胞、HL-60细胞以及HeLa细胞的增殖；进一步的研究表明，这一过程是通过线粒体凋亡路径实现的，并且在此过程中与胰蛋白酶抑制剂的构象变化有关。Guo X等人[22]从荞麦水溶蛋白分离到1个名为TBWSP31的多肽，相对分子质量为57 000 Da。研究发现，TBWSP31通过上调细胞凋亡基因Fas和下调细胞凋亡基因BLC-2，引起人乳腺癌细胞株Bcap37G0/G1细胞周期阻滞，实现抑制肿瘤增殖的效果，同时该调控过程存在时间效应和剂量效应。另外的研究表明，与膳食纤维类似，荞麦蛋白的生理活性与其低消化性有关。通过喂食模型鼠荞麦蛋白降低血清雌二醇的含量，从而延缓乳腺癌病程；还有研究表明，喂食荞麦蛋白能够抑制结肠癌模型鼠中C-myc蛋白和C-fos蛋白的表达，同时抑制癌细胞的增殖[23]。

3.4 对高胆固醇和肥胖的抑制作用

Kayashita J等人[24]的研究证明，荞麦蛋白提取物能够降低模型鼠中的血浆胆固醇水平，这可能与荞麦蛋白中独特的氨基酸配比有关，与其他蛋白质相比，荞麦蛋白的赖氨酸与精氨酸比例较低。周小理等人[25]采用硫酸铵盐析法、葡聚糖凝胶-琼脂糖快速离子交换层析法制备了苦荞水溶性蛋白，研究其对胆酸盐的吸附作用。结果显示，对胆酸盐、脱氧胆酸盐的吸附率都超过了90%，由此证实了苦荞水溶性蛋白的降血脂功能。荞麦蛋白可消化性较低，当未降解的荞麦蛋白进入胃肠道时，胆汁酸与其结合形成中性固醇随粪便排出，这一过程刺激了由胆固醇到胆汁酸的合成，从而降低了胆固醇的浓度；其机理可能与荞麦蛋白能够降低胆固醇吸收蛋白和酰基转移酶的活性有关。与酪蛋白和大豆蛋白相比，荞麦蛋白对于降低血液胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的效率更高。通过降低肝脂肪合成酶的活性进而降低甘油三酯的浓度，从而达到减肥降体重的目的。

3.5 降血压作用

肾素-血管紧张素系统（RAS）在血压调节方面发挥着十分重要的作用，通过将血管紧张素转化酶-I转化为血管紧张素转化酶-II的方式来升高血压。Guang C等人[26]的研究表明，来源于荞麦的短肽能够抑制血管紧张素转化酶-I的活性，这些短肽大多数由2～5个氨基酸残基组成。Li C H等人[27]从荞麦蛋白水解液中分离出了降血压肽；Koyama M等人从荞麦芽中分离并纯化得到降血压肽；随后的动物试验显示，其在原发性高血压大鼠降血压方面有显著作用。Cheung H S等人的研究认为，短肽羧基端的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基与血管紧张素转化酶-I的活性中心结合，能够产生明显的降血压作用，来源于荞麦降血压肽类的羧基端，均含有上述氨基酸残基。

3.6 降血糖作用

流行病学显示，食用荞麦食品能够起到降“三高”（高血压、高血糖、高血脂）的效果。荞麦中降血糖的成分主要是D-手性肌醇、黄酮类以及荞麦蛋白，以芦丁为代表的黄酮类物质能够清除人体的活性氧，而活性氧可能会引起糖尿病以及诱发对胰岛细胞的损伤。试验证实，通过增加抗氧化酶的活性和清除活性氧等途径，摄入体内的荞麦蛋白能够用于治疗糖尿病。崔霞等人[8]采用碱性蛋白酶提取到相对分子质量在100～1 000 U的低分子量活性肽，动物试验表明其能够有效抑制体外脂质过氧化反应的发生，对四氧嘧啶所致糖尿病起到降低血糖的作用。Ma Y等人的研究表明，相对于将荞麦蛋白与胃蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的产物而言，2～5个氨基酸残基组成的短肽具有更强的抗氧化活性。因此，有可能将这些短肽制成药品用于脂代谢异常和糖尿病的临床治疗。

4 展望

荞麦在全世界广泛种植，蛋白中氨基酸种类全面、配比得当，其所含的活性肽功能营养因子受到人们的广泛关注。当前，国内外对荞麦蛋白活性肽的制备、纯化、结构鉴定和生物活性等方面研究取得了很大进展，在降血压、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等方面也发现了生物活性。同时，进行横向比较发现，国内外对荞麦肽的研究成果远不及对大豆肽、花生肽等植物蛋白来源的活性肽研究。荞麦活性肽的研究主要局限在其酶解工艺上，大部分研究成果只是获得了具有一定生物活性的水解混合物，对其活性肽的进一步分离纯化、结构鉴定、生物活性与肽结构的构效关系研究较少，亟待进一步的深入拓展。此外，生物活性肽研究领域中的一些新技术和方法，如多酶偶联控制技术、定量构效关系建模方法（QSAR）等，亦可作为未来研究开展工作的新领域。

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Research Progress and Prospect on Bioactive Peptides in Buckwheat

GUO Hong，*LI Yunlong
（Institude of Agricultural Products，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan，Shanxi 030031，China）

Buckwheat is the important crops with effect of nutrition and health.It isnutrient-rich，and there are much proteins which is a good source of buckwheat peptides.This paper reviews the preparation，purification，structure and biological activity of buckwheat bioactive peptides and discussed its further research development，aims to provide the references for the related research.

buckwheat；protein peptides；bioactivity

S517

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.039

1671-9646（2016）12b-0040-04

2016-11-24

山西省农科院科技攻关课题（YGG1410）。

郭 洪（1982— ），男，硕士，助理研究员，研究方向为特色农产品加工。*

李云龙（1979— ），男，硕士，副研究员，研究方向为特色农产品加工。