葡萄酒中2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）检测新技术的研究进展

周立华，牟德华，李　艳，2（.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄05008；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄05008）



葡萄酒中2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）检测新技术的研究进展

周立华1，牟德华1，李艳1，2
（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

摘要：2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）是危害葡萄酒感官品质的一种物质，通常来自于葡萄酒封装所用的软木塞，也可能来自葡萄原料或酿酒过程中的污染，它的存在使葡萄酒产生不良气味和口感。简介了最近十几年来检测葡萄酒中TCA的新方法和新仪器，包括葡萄酒中TCA的萃取技术和检测技术。并对这些新技术的特点、原理及应用优势进行了阐述。目的是为对葡萄酒中的TCA做到精确、低检出限和高灵敏性的定性及定量测定提供参考，从而对葡萄酒中的TCA进行准确的监测，最终提高葡萄酒的品质。

关键词：2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）；葡萄酒；萃取；检测；新技术

优先数字出版时间：2016-03-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1545.009.html。

葡萄酒作为人们餐桌上的饮料酒，正在被越来越多的人们所接受，而随着生活水平的提高，葡萄酒品质问题也逐渐引起人们的重视，而葡萄酒中的2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）就是造成污染的原因之一。葡萄酒中含有极低量（ng/L级）的2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）即可影响葡萄酒的气味和口感。TCA在葡萄酒中的感官阈值一般在1.4～4.6 g/L［1-2］，通常3.1ng/L为人们所接受的最高浓度［3］。据统计，有2%～5%的葡萄酒会受到TCA的污染［4］。在葡萄酒酿造过程中因原料和生产场地污染可能会产生极少量的TCA，但葡萄酒中TCA的来源主要是封装酒瓶的软木塞。因葡萄酒中TCA含量极低，要准确测定对萃取和检测环节的要求极高。近年来国内外学者研究开发出了很多新方法、新仪器和新技术，力求提高葡萄酒中TCA检测的精准性。本文汇总阐述最近十几年来检测葡萄酒中TCA的新方法和新仪器，为精确、低检出限和高灵敏性的定性和定量测定葡萄酒中TCA提供参考。

1葡萄酒中TCA的来源

20世纪末，某些欧洲国家进行了一项名为“栎木工程”的研究，其主要目的是研究葡萄酒因为软木塞污染而产生异味的原因。研究结果表明，80%出现软木塞污染的装瓶葡萄酒所散发出的霉味是由TCA造成的［5］。因此，TCA对葡萄酒的污染成为很多科研工作者的研究内容。TCA最主要的来源是封装葡萄酒的软木塞。研究表明，在污染产黄青霉菌、拟青霉菌和光孢青霉菌的软木塞中，TCA含量极高。软木中的2，4，6-三氯苯酚（TCP）经霉菌的甲基化作用产生TCA［6］。除软木塞引入葡萄酒TCA外，葡萄原料和葡萄酒酿造过程、橡木桶陈酿过程等的污染也是葡萄酒中TCA的来源，如在葡萄生长过程中，为了防治病虫害而使用的杀真菌剂、杀菌剂和除草剂等农药，橡木桶在制作过程中用到的含有五氯苯酚（PCP）、2，3，4，6-四氯苯酚（2，3，4，6-TeCP）和2，4，6-三氯苯酚（TCP）的木材防腐剂等［7-8］，都可能造成葡萄酒中TCA的污染。

2葡萄酒中TCA的常规萃取与检测方法

国际标准化组织ISO在2007年制定，2014年修订了检测葡萄酒及软木塞中可释放TCA的标准ISO 20752—2014。该标准所规定的方法是用12%vol酒精-水溶液浸泡软木塞24h，采用固相微萃取提取浸泡液中的TCA，再以2，4，6-TCAd5为内标物，采用气相色谱电子捕获检测器（GC-ECD）或气相色谱-质谱（GC-MS）进行检测［9］。然而该方法在实施过程中因样品中TCA的萃取和检测两个最重要环节具体的TCA萃取条件、仪器类型、检测人员等不同，致使检测结果容易出现极大的误差。

2.1样品中TCA的萃取

2.1.1顶空固相微萃取法（Headspacesolid-phase microextraction，SPME）

固相微萃取一般也称为顶空固相微萃取技术，是利用涂有特定高分子固相聚合物液膜的玻璃纤维萃取头对样品进行萃取，萃取头在样品液面之上，通过对样品水浴使挥发性成分进入顶空中，从而被萃取头所吸附［10］。该方法在萃取过程中萃取头不与液体接触，避免了样品基质的干扰，是目前较常见的富集萃取方法。ISO 20752—2014中是采用100μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层的纤维头对12%vol乙醇模拟葡萄酒基质的软木塞浸泡液进行顶空固相微萃取（HS-SPME），应用GC-ECD或GC-MS测定TCA，其最低定量限（LOQ）可达到0.5ng/L。M.Riu等［11］在几种软木塞中的TCA及5种氯苯甲醚的检测中对6种固相萃取头进行了优化选择，以TCA的峰面积为比较对象，最终50/30μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）的萃取头效果最优，测得的TCA的检测限为0.8ng/g，回收率在90.3%～105.8%，相对标准偏差（RSD）4%～13%。Lizarraga E等［12］利用顶空固相微萃取技术结合GC-MS对红葡萄酒中的TCA等物质进行检测，同时优选萃取头，从5种萃取头中选择出100μm PDMS。经检测，TCA的回收率＞95%，RSD＜5%，LOQ为0.1ng/L。李艳等［13］采用L18（73）正交试验法优化了顶空固相微萃取TCA的条件，结果是：萃取头涂层为聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB），12%vol乙醇软木塞浸泡液体积10mL，平衡20min，萃取35min，30%NaCl，萃取温度30℃，搅拌转速40r/s，并且比较了GC-ECD和GC-MS两种检测方法，结果表明，GC-MS的回收率要优于GC-ECD，但是检出限GC-MS要高于GC-ECD，可见TCA萃取条件和萃取头涂层对检测结果都有影响。

2.1.2液液萃取法（Liquid-liquid extraction，LLE）

液液萃取法是应用较早的样品前处理萃取技术，Peña-Neira A等［14］在对葡萄酒和软木塞中的TCA等4种氯代苯甲醚和3种氯酚类物质的检测中应用了液液萃取技术，试验中分别用10mL和5mL正戊烷在4℃下萃取软木塞和葡萄酒样中的TCA等物质24h，共萃取3次，最后合并有机相，氮吹浓缩至50μL，用GC-ECD进行检测，进样量10μL，检测结果显示：TCA的LOD 0.5ng/L，并且验证了葡萄酒的污染和软木塞污染之间的相关性。该方法虽应用广泛，但在TCA的萃取中应用较少，原因是该技术需要大量有机溶剂，萃取时间长，且萃取效果不佳，回收率低等［15］。

2.1.3固相萃取法（Solid Phase Extraction，SPE）

固相萃取（SPE）技术是从20世纪80年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术，具有回收率和富集倍数高、有机溶剂用量少、无相分离操作、能处理微量样品和易于实现自动化等优点［16］，该技术主要利用样品流经固体吸附剂时，不同化合物与吸附剂间的吸附与解吸附作用，将液体样品中的目标化合物与样品基底以及干扰化合物分离，再通过洗脱液迅速洗脱，达到分离和富集的效果［17］。固相萃取技术在TCA的检测中具有较广的应用前景，检测的基础是对固相萃取柱的填料进行选择，常用的填料有C8、氰基、氨基、苯基、双醇基填料，活性炭、硅胶、氧化铝、硅酸镁、聚合物、离子交换剂、排阻色谱填料、亲合色谱填料等。Insa S等［18］以LiChrolut EN树脂为填料进行固相萃取，处理前加入12.5mL甲醇和水溶液，添加1%的NaHCO3，对挥发性物质进行去除，为了增加进样量，试验在进样口增加了一个大容量注射器，进样量为40μL，采用GC-MS对TCA和2，4，6-三溴苯甲醚（TBA）进行检测，其RSD都小于6%，LOD值分别为0.2ng/L和0.4ng/L。

2.2测定TCA常用的方法

2.2.1气相色谱电子捕获检测器（GC-ECD）测定TCA

在TCA的检测中应用较为普遍的是GC-ECD技术，该法利用了ECD检测器对卤素较敏感［19］、高灵敏度和高选择性的特点。Slabizki P等［19］利用SPME技术对葡萄酒及软木塞中的TCA进行萃取浓缩，结合GC-ECD进行检测，采用同位素内标法进行定量，得出TCA的LOD为0.1ng/L，体现了高灵敏度。Vlachos P等［20］同样利用SPME的前处理法对葡萄酒及软木塞中的TCA进行萃取，以2，3，6-三氯甲苯（2，3，6-TCT）为内标物，利用GC-ECD进行检测，结果显示：标准曲线R2＞0.99，RSD= 5.72%，回收率＞86%，葡萄酒中的LOD值在0.177～0.368ng/L之间，证明了很高的灵敏性。此外Riu M等［5，21］及ISO检测标准［9］也利用了GC-ECD检测方法对TCA进行检测分析。该方法是对痕量物质检测中较为常见的检测方法，可以进行葡萄酒及软木塞中的TCA测定。

2.2.2气相色谱与质谱联用（GC-MS）测定TCA

在葡萄酒及软木塞中TCA的检测中，也较常用GCMS，该方法在定性方面优于GC-ECD，对目标物质进行特征离子定性更准确。该方法包括了气相色谱离子阱质谱法（GC-ITMS）、气相飞行质谱联用法（GC-TOF-MS）、气相色谱串联四极杆质谱法（GC-MS）和气相串联质谱法（GC-MS/MS）等。Insa S等［18］以SPE法为TCA的前处理提取方法，以GC-ITMS检测葡萄酒中的TCA，结果表明，LOD为0.2ng/L，体现了高灵敏性。Carasek E等［22］利用了内部冷却顶空固相微萃取（CF-HS-SPME）技术，以GCTOF-MS检测软木塞中的TCA，得出LOD=0.25ng/g，R2= 0.994的检测结果。Jönsson S等［23］采用SPME处理样品，通过气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）检测，以质荷比（m/z）210、212为TCA的定性离子，174为其定量离子，结果显示：LOQ值为30 pg/L，R2=0.9975，RSD=3.5%。

3 TCA萃取与检测新技术

TCA检测新技术是指近年来在检测葡萄酒及软木塞中应用的新方法和新仪器，在很多方面可以弥补传统方法的不足，适合不同的检测环境，包括样品中TCA萃取和检测两方面，如多次顶空固相微萃取（MHS-SPME）、内部冷却固相微萃取（CF-HS-SPME）、顶空单滴微萃取（HS-SDME）、漩涡辅助液液微萃取（VALLME）、加压流体萃取（PFE/ASE）、超声辅助乳化微萃取（USAEME）、超临界流体萃取（SFE）等TCA萃取法，大大缩短了萃取时间。在新检测方法中毛细管柱分离和离子迁移质色谱联用检测法（MCC-IMS）可以在毫秒级（ms）的检测时间内对TCA进行检测，具有快捷、适合某些特殊环境检测的特点。

3.1样品中TCA萃取新技术

3.1.1以固相为萃取基质的新方法

以固相为萃取基质的方法是目前对痕量成分富集萃取最常见的方法，其操作步骤相对于溶剂萃取要简单、不用大量有机溶剂、萃取时间短、需要样品量少，对于一些珍贵酒样的测量比较实用，但存在萃取头易损耗的缺点。萃取前需对所用萃取头涂层的种类和厚度进行选择，对萃取条件，如离子强度（一般加入NaCl）、样品量、萃取温度、平衡时间、萃取时间和搅拌速率等进行优化。

3.1.1.1空间分辨固相微萃取（space- resolved solid phase microextraction，SR-SPME）

空间分辨固相微萃取技术是近年来应用于TCA的萃取方法，其低检出限与灵敏性，可以极大程度的对目标物质进行萃取，具有高度浓缩萃取的特点，目前被越来越多的人所应用，其主要的原理就是将萃取针头分为两部分，中间隔开，上下两部分为具有不同萃取特点的固定相，可以对不同特点和极性的物质进行萃取，可以部分与液体接触。国内的Liu M等［24］分别以石墨烯（graphene）和石墨烯氧化物（graphene oxide）为萃取纤维的涂层，对葡萄酒中的TCA和DBP（邻苯二甲酸二丁酯）进行了萃取，石墨烯萃取涂层以顶空的形式对挥发的TCA进行萃取，而石墨烯氧化物涂层深入液体中对邻苯二甲酸二丁酯进行萃取，结合GC-MS的检测手段，最终得到TCA的检测限为0.3ng/L，精密度达到了5.4%，回收率也达到了96.96%，通过建立空间分辨固相微萃取技术，达到了对葡萄酒中的TCA进行富集萃取的目的，进而对葡萄酒中的微量TCA进行测定。

3.1.1.2分散固相萃取（Dispersive solid phase extraction，DSPE）

DSPE和SPE技术相似，都是以固体为萃取基质，不同之处是SPE一般利用萃取柱，而DSPE可以直接把萃取固体加入到样品中，这种技术最早在2003年提出，具有快速、简便、廉价、高效、耐用和安全的优点［25］，但是一般LOD值较高。Patil S H等［26］以甲苯为萃取剂对酒样进行萃取，萃取液加入到含100 mg无水CaCl2、25 mg乙二胺-N-丙基硅烷和50 mg无水MgSO4的萃取容器中进行分散固相萃取，同时利用气相-飞行质谱（GC-TOFMS）和气相-串联质谱（GC-MS/MS）进行检测方法的优化研究。结果表明，GC-TOFMS更省时间，而GC-MS/MS精确度高，LOD值为0.0083ng/L，回收率80%～110%，R2＞0.999。

3.1.1.3多次顶空固相微萃取（Multiple headspace solid phase microextraction，MHS-SPME）

MHS-SPME技术是指针对同一样品进行多次连续萃取，目标分析物的总量为多次SPME量的总和，计算公式为：AT=A1/（1-β），β可由公式lnAi=（i-1）lnβ+ lnA1来确定，式中A1和AT分别代表第1次萃取和第n次萃取后色谱峰的总面积，A1和Ai分别代表第1次和第i次的萃取峰面积［27］。该方法无需考虑待分析物在顶空和固相微萃取涂层间的分配系数，而只需达到吸附平衡即可，因此可以去除顶空分析时的基质效应。Ezquerro Ó等［28］运用MHS-SPME技术萃取软木塞中的TCA，使用的萃取头是50/30μm DVB-CAR-PDMS，结合GC-MS分析检测，结果LOD=0.006ng/mL，R2=0.995。MHS-SPME有更好的检测灵敏性，更适合对软木塞和葡萄酒中痕量的TCA进行精确的萃取和检测。

3.1.1.4侵入式固相微萃取（Intrusive solid phase micro extraction，IS-SPME）

IS-SPME技术是将涂有萃取涂层的萃取纤维头直接插入液体或者气体样品中进行萃取的一种萃取浓缩技术，该技术比SPME技术灵敏度更高［28］。Maggi L等［29］比较了搅拌棒吸附萃取法（SBSE）、顶空固相微萃取（HSSPME）和侵入式固相微萃取（IS-SPME）3种萃取技术。IS-SPME选用100μm PDMS萃取头，在室温、700r/min下对葡萄酒中的TCA等物质进行萃取，再通过GC-MS/ MS技术进行检测，结果显示，IS-SPME的灵敏度是HSSPME的188.4倍，测得TCA的LOD值为0.46ng/L。

3.1.1.5内部冷却顶空固相微萃取（Internally cooled solid-phase microextraction，CF-HS-SPME）

CF-HS-SPME技术是在顶空固相微萃取装置基础上增加一个对萃取纤维头进行冷却的装置，在对样品进行加热的同时，对萃取纤维进行冷却，当挥发性成分在加热条件下挥发进入顶空时，遇到冷却状态下的萃取纤维头，从而增加了分析物和纤维涂层之间的分配系数，被快速高度的浓缩［30］。Carasek E等［22］对比了CF-HS-SPME 和HS-SPME两种萃取方法，CF-HS-SPME的萃取头涂有聚二甲基硅氧烷涂层，结合GC-MS检测软木塞中的TCA等物质，结果显示，仅用10min的萃取效果远远超过了HS-SPME的75min萃取效果，TCA的LOD值为0.25ng/g，R2=0.994，其检测效果优于HS-SPME，萃取时间比常规方法短，并且达到不损害样品检测的目的。

3.1.1.6搅拌棒吸附萃取法（Stir bar sorptive extraction，SBSE）

SBSE萃取技术是将聚二甲基硅氧烷（PDMS）套在内封磁芯的玻璃管上作为萃取涂层，对样品中的待测物进行吸附，待萃取完成后，通过热解吸仪对待测物进行热解吸，供气相色谱分析［31］。R.M.Callejon等［32］建立和检测了软木塞中TCA等8种物质的检测方法，在前期乙醇萃取中使用了大容量萃取和低容量萃取2种方法，乙醇萃取完成后，利用涂有聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层的搅拌棒对萃取溶剂进行再一次的萃取，条件为700r/min下搅拌60min，结合GC-MS检测，定性荷质比为195，结果显示：TCA的LOQ=1.2ng/g，R2=1。Cacho J I等［33］利用SBSE萃取结合GC-MS技术对包括干红、干白和桃红共30种葡萄酒中的TCA等物质进行了检测，萃取条件为：加入10%（w/v）NaCl，pH3.0，萃取2h，结果显示，TCA 的LOD值为0.4ng/L，RSD 4.3%，6种酒样中的TCA在32ng/L以上，属TCA超标酒。

3.1.1.7搅拌棒-微波辅助萃取联用法（stir bar sorptive extraction-microwave assisted extraction，SBSE-MAE）

在搅拌棒萃取的基础上增加微波辅助萃取技术，对软木塞中TCA的检测时一般都要制备浸出液，浸出步骤操作简单，但耗费大量时间，例如ISO标准中要在模拟酒样中浸泡24h±2h才能进行后续其他步骤，微波辅助萃取法的应用缩短了这一操作时间。Jochen Vestner等［34］用10%vol乙醇溶液浸泡软木塞，采用搅拌棒辅助微波萃取技术，优化的萃取条件为40℃萃取2h，然后冷却90min到室温，与普通的浸泡萃取时间为24h作对比；再利用涂有0.5 mm PDMS涂层的搅拌棒进行1000r/min，60min吸附萃取，以GC-MS检测，以同位素内标法进行定量，和普通的浸泡萃取技术相比，结果显示，以微波辅助技术对软木塞进行浸泡，节省大量时间，RSD分别为9.1%～14.4%和11.6%～26.6%，且重复性更好，R2=0.9997，LOD=0.5ng/L。

3.1.2以液相为萃取基质的新技术

以液相为萃取基质的技术可以分为液液萃取和液液微萃取。液液萃取是利用有机溶剂对物质进行萃取，一般有机溶剂用量较大，而液液微萃取有机溶剂用量相对少得多。目前对酒中和软木塞中TCA的检测中最近几年发展最快的是微萃取技术，该方法可将目标物的萃取、纯化、浓缩集中于一步操作中完成，经济并可循环利用，不存在萃取头损耗的缺点［35］。影响该方法萃取效率的因素有离子强度、萃取溶剂、萃取温度、萃取时间和样品pH值等，在萃取前必须进行优化实验，以达到最有效的萃取效果。

3.1.2.1顶空单滴微萃取（Headspace single drop microextraction，HS-SDME）技术

HS-SDME利用了目标分析物在体系中三相之间的分配平衡，此三相分别为样品溶液、萃取溶剂和萃取微滴所在的样品溶液上方的气相。操作步骤是将微量的有机溶剂或离子液体吸入微量进样器中，将其插入装有样品的顶空瓶中，使溶剂悬挂于进样器的顶端进行对挥发物的吸附，待萃取完成后抽回萃取液滴并将微量进样器从样品瓶中拔出，直接将此液滴注射到GC中进行分析［35］。吸附溶剂分2种：一种是有机溶剂，只要具有吸附性即可；另一种是离子液体，又称室温离子液体或室温熔融盐，由阴阳离子组成，室温或低温下呈液态［36］，主要有季磷酸盐、季铵盐、咪唑、噻唑、吡啶和吡咯啉类等。

Martendal等［35］以2μL有机溶剂1-正辛醇为萃取剂，对葡萄酒中TCA进行萃取，65℃萃取30min，利用GCECD检测，结果显示，LOD值为8.1ng/L；Márquez-Sillero I等［37］以离子液体1-己基-3-甲基咪唑双（三氟甲基黄酰基）亚胺盐（［Hmim］［NTf2］）为萃取溶剂，对葡萄酒中TCA进行前处理，样品中NaCl含量为350 g/L，30℃萃取20min，搅拌速率500r/min，结合离子迁移谱法（IMS），得到TCA的LOD值为0.2ng/L，所建方法TCA 10ng/L时的精确度为1.4，RSD 2.2%。

3.1.2.2漩涡辅助液液微萃取（Vortex-assisted liquidliquid microextraction，VALLME）

VALLME是一种高效、快捷、方便和经济的方法，它允许重复测量，只需要小体积的提取溶剂，利用了微量萃取剂在样品中扩散距离短和比表面积大的特性，使平衡更快。它是将微量有机溶剂加入到样品中，漩涡一段时间，静置分层，取出微量有机溶剂，进行检测［38］。Pizarro C等［39］利用VALLME检测葡萄酒中的TCA，利用响应面优化萃取条件，结果为5mL葡萄酒加入到10mL小瓶中，加入135μL萃取溶剂，加0.28 g NaH2PO4使pH7.6，0.15 g NaCl，2500r/min漩涡辅助液液微萃取7min，萃取溶剂比较了四氯化碳、氯苯、氯仿、二硫化碳和四氯乙烯的萃取效率，最终发现，四氯乙烯为最适溶剂，收集萃取相，结合GC-μECD检测，LOD值为2.1ng/L。VALLME具有方便和节省样品处理时间的优点。

3.1.2.3分散液液微萃取法（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）

DLLME技术具有较高的富集能力，可以对极微量物质进行萃取，是指萃取溶剂（密度大于水且不溶于水）和分散溶剂（和水及萃取剂有好的相容性）被注入到样品中，进行快速萃取，萃取完成后进行离心使其分层，用进样器取出萃取溶剂，进行仪器分析［40］。Pizarro C等［41］对软木塞和葡萄酒中的TCA进行了萃取，在室温下，5mL酒样或软木塞浸泡液倒入10mL玻璃管中，加入1.43mL丙酮为分散剂，173μL氯仿为萃取剂，不添加盐类物质，萃取结束后，5000r/min离心2min，用微进样器在离心后的玻璃管底部分离出有机相，GC-MS/MS进行检测，结果显示：当S/N=3时，TCA的LOD值为5.0ng/L，R2= 0.995，RSD＜7.1%。

3.1.2.4加压流体萃取（Pressurized fluid extraction，PFE）技术

PFE也称加速溶剂萃取（ASE），是一种主要对固体和半固体样品进行目标成分萃取的样品前处理方法，其原理为通过高压，使溶剂和挥发性物质即使在高温环境下（高于沸点）依然保持液相状态，从而降低溶剂和目标物质的损失，提高萃取效率，该方法操作简单、污染小、溶剂消耗量少、易于自动化［42］，对氯代苯类物质的萃取效果灵敏，适合对TCA提取。PFE的萃取步骤为：①将样品加入到提取池；②填充有机萃取溶剂；③加压和加热提取池，在设定的条件下提取；④收集有机萃取溶剂；⑤用新鲜溶剂进行清洗，用氮气流进行吹洗；⑥萃取剂氮气浓缩，进样［36］。Ezquerro Ó等［43］做了PFE、MHS-SPME和索氏提取法（Soxhlet procedures）对软木塞中TCA和愈创木酚萃取效果的比较实验，综合多个因素考虑，PFE被选为样品的处理方法，实验中取0.75 g软木塞用正戊烷分3次进行萃取，在压力10.4MPa，150℃下萃取14min，结合GC-MS检测，结果显示：TCA的回收率101%，RSD 7%～11%间，证明了PFE是一种具有低溶剂消耗量和萃取时间短等优点的前处理方法。

3.1.2.5超声辅助乳化微萃取（Ultrasound-assisted emulsification microextraction，USAEME）

USAEME是一种在样品中加入适合有机溶剂，然后进行超声波处理，使溶剂和样品达到均匀乳化状态，快速达到传质平衡，进行高效萃取，然后离心分离，最后进行仪器检测的快速、简单和高效的样品前处理方法［44-46］。Fontana A R等［47］取5mL酒样放入10mL玻璃离心管中，加400μL 6.15mol/L NaCl溶液和500μL 0.013mol/L四硼酸缓冲溶液，25μL三氯乙烯为萃取溶剂，20℃超声5min，3500r/min离心2min，分离离心管底部的溶剂，1μL用于GC-MS/MS检测，结果显示：TCA≤10ng/L时，LOD值为0.6～0.7ng/L，RSD≤11.3，R2=0.9995。

3.1.2.6超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）技术

SFE技术是利用了溶剂在超临界状态下呈现气液不分的状态，性质介于气体和液体之间，具有优异的溶剂性质，其密度接近于液体密度，并随流体压力和温度的改变发生十分明显的变化，而溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大。SFE正是利用这种性质，在较高压力下将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因其密度下降、溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取［48-49］，SFE最常用的溶剂是CO2。Taylor M K等［50］以CO2为提取溶剂对软木塞中的TCA进行了萃取，经过优化：0℃为萃取温度，25℃为解析温度，在250 bar，CO2流量2mL/min，萃取时间15min，目标物在解析后用1mL/min甲醇进行再溶，结合GC-MSD进行检测，同位素内标法定量，结果显示：LOD值为5pg/g，回收率97%～103%，可以看出，SFE是一种快速、高效和便于自动化的萃取技术。

3.2TCA检测新方法

3.2.1毛细管柱分离和离子迁移谱联用技术（Multicapillary column and ion mobility spectrometry，MCC-IMS）

MCC-IMS是利用毛细管色谱进行物质分离，进入离子迁移谱仪后目标物质被电离为离子，随后被注入到一个均匀电场中进行定向迁移，由于各离子的质量和大小等不同，所以在电场中的迁移速度不同，最终达到分离，按照先后顺序得到谱图对应不同物质的特征时间峰［51］。离子迁移谱用于痕量物质的检测，LOD值一般为ng级，甚至为pg级，分析时间为s级。Márquez-Sillero I等［37］利用单液滴微萃取作为前处理方法，2μL进样，经50mL/min 的N2流仪器进入毛细管柱进行分离，然后进入离子迁移谱仪进行离子分离定性定量，结果显示：TCA峰出现在6～8 ms时间内，TCA的LOD值为0.2ng/L。可以看出，MCC-IMS检测法的检测时间短，是快速检测的最优选择，在某些要求快速定量的状况下被广泛应用。

3.2.2气相与原子发射光谱联用（Gas chromatographyatomic emission detection，GC-AED）技术

原子发射光谱法（AED）是一种比质谱灵敏性更高、选择性更好、操作更简单的检测方法，是利用物质在热激发或电激发下，不同元素的原子或离子发射特征光谱的差别来判断物质的组成，进而进行元素的定性与定量分析的方法［52］。Campillo N等［53］利用吹扫捕集法对葡萄酒及软木塞进行了前处理，物质进入气相进行分离，然后利用AED进行定性定量分析，检测结果：软木塞和酒中TCA的LOD值分别为25 pg/g和5ng/L，回收率在88.5%～102.3%之间。可以看出，GC-AED技术在对TCA的检测中有很高的灵敏性，该技术可以对一些要求较高的葡萄酒中的TCA进行检测。

3.2.3循环伏安法（Cyclic voltammetry，CV）

CV以等腰三角形的脉冲电压加在工作电极上，得到的电流电压曲线包括两个分支，如果前半部分电位向阴极方向扫描，电活性物质在电极上还原，产生还原波，那么后半部分电位向阳极方向扫描时，还原产物又会重新在电极上氧化，产生氧化波。因此一次三角波扫描，完成一个还原和氧化过程的循环，故该法称为循环伏安法，其电流-电压曲线称为循环伏安图，再通过峰面积减去空白的峰面积与相应浓度做线性，最终进行定量［54］。Peres A M等［54］利用CV法对软木塞中的TCA进行了检测，实验采用乙腈和水3∶2（v/v），扫描速度为100 mV/s，结果为：LOD值为0.31ng/L，LOQ值为0.95ng/L，RSD＜3%，该方法的检测限低，且重复性好。

3.2.4飞行质谱电晕放电离子迁移光谱联用（CD-IMS-oaTOF）技术

CD-IMS-oaTOF是在放电离子迁移谱法中增加电晕放电高压电场，使物质产生高能电子，再由电子迁移谱仪进行电子迁移，电子经过迁移分离后进入飞行质谱进行定性定量检测［55］。Lichvanová Z等［55］利用CD-IMS-oaTOF技术定性定量测定TCA，TCA在气相中LOD值为100 μg/L，在固相中RSD为150ng/L，检测在20 ms内完成。由检测结果可以看出，该方法的检测限灵敏度并不高，但节省检测时间，对TCA能够达到快速测定的目的，适合一些特殊情况下的检测。

3.2.5其他检测新技术

生物传感器法（Biosensor）是利用生物膜系统免疫特性点识别检测，生物点识别检测是基于细胞膜内含有人工制造的待测物特异性抗体，可与样品中的待测物结合，使固定细胞的膜电位改变并对其识别，从而对待测物进行检测［56］。Apostolou T等［56］以pAb78为多克隆抗体，在生物传感器系统上样品通过浸入软木组织并直接与细胞生物识别元件相连，没有干预萃取过程，以生物膜上电位的变化对软木中的TCA进行检测分析，得出R2=0.9864，LOD值为0.2ng/L，检测时间5min。该方法快速、不用有机溶剂、便携，可直接应用于现场，对软木塞进行高通量筛选，无需任何类型的配套基础设施。

酶联免疫吸附法（ELISA）是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合而建立的一种免疫分析方法，主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性［57］。Moore E等［57］利用特异性酶联免疫吸附法对TCA进行了测定，以碱性磷酸酶（AP）为标记物，通过TCA与半抗体的竞争关系对TCA进行特异性检测，结果显示LOD值为1ng/mL。该方法特异性强、简单和快速，但灵敏性较差。

4 TCA污染的防治

对于葡萄酒行业，防治TCA污染是很严峻的问题，要想减少其对葡萄酒的污染，减少经济损失，就要在葡萄酒的制作原料、酿造过程和软木塞封装等环节进行严格防控。在葡萄生长成熟期严禁使用含有氯酚类物质的除草剂、杀虫剂等有机农药，减少TCA的污染。同时，严禁使用发霉的软木塞封装葡萄酒。在发现酒体或软木塞污染了TCA后，在不影响葡萄酒品质和不破坏软木塞的前提下，利用一些手段对TCA进行去除，C.Pereira等［58］利用γ射线法降低了软木塞中TCA的含量，试验证明，当γ射线强度为100 kGy时，软木塞中的TCA减少量为97.9%，对软木塞中TCA的去除效果明显，且不会破坏软木塞；Vlachos P等［59］通过溶胶-凝胶法，以0.7 g Triton X-100［聚氧乙烯-（10）异辛基苯基醚］为表面活性剂，加入3.8mL乙醇、0.68mL冰醋酸和0.36mL异丙醇钛，然后剧烈搅拌，制得二氧化钛薄膜，把TCA加入到薄膜中，通过使用低强度黑光管发射的近UV光对其进行光解，对比臭氧和H2O2对TCA的去除效率，实验结果表明，以二氧化钛薄膜加以UV光对TCA进行光解的降解速率常数为0.084r/min，高于臭氧和H2O2对TCA的降解速率常数，是降低软木塞中TCA含量的有效方法。

5结论与展望

TCA检测新技术的开发重点正在向快速、高精准度、高灵敏性和低检出限发展，这些新技术推动着TCA检测标准向高专业性和高标准化发展。随着人们对TCA污染问题的关注，对TCA检测的新方法、新设备和新技术的开发与利用，将成为科研工作者研究的热点课题，并会随之产生很多新成绩。但是，在目前的研究手段和方法下，我们也不得不承认，由于TCA低阈值的特点，集快速、高灵敏性、低检测限和经济实用于一体的TCA萃取和检测技术的开发研究对任何科研工作者来说仍然还是一个挑战，这也会吸引大量的科研工作者为之努力。

参考文献：

［1］Mazzoleni V，Maggi L.Effect of wine style on the perception

of 2，4，6-trichloroanisole，a compound related to cork taint in wine［J］.Food Research International，2007，40（6）：694-699.

［2］Garcia AR，Lopes L F，de Barros R B，et al.The Problem of 2，4，6-trichloroanisole in cork planks studied by attenuated total reflection infrared spectroscopy: proof of concept［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63（1）：128-135.

［3］Prescott J，Norris L，Kunst M，et al.Estimating a“consumer rejection threshold”for cork taint in white wine［J］.Food Quality and Preference，2005，16（4）：345-349.

［4］Chatonnet P，Dubourdie D，Boidron J，et al.The origin of ethylphenols in wines［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1992，60（2）：165-178.

［5］Riu M，Mestres M，Busto O，et al.Determination of 2，4，6-trichloroanisole in wines by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-electron-capture detection［J］.Journal of Chromatography A，2002，977（1）：1-8.

［6］Prak S，Gunata Z，Guiraud J P，et al.Fungal strains isolated from cork stoppers and the formation of 2，4，6-trichloroanisole involved in the cork taint of wine［J］.Food Microbiology，2007，24（3）：271-280.

［7］樊双喜，张哲琦，李艳.气相色谱串联质谱（GC-MS）检测葡萄酒及软木塞中TCA的研究进展［J］.酿酒科技，2013（12）：74-79.

［8］Pereira C S，Marques J J F，San Romao M V.Cork taint in wine: scientific knowledge and public perception—a critical review［J］.Critical Reviews in Microbiology，2000，26（3）：147-162.

［9］International Standard Organization.Cork stoppers—determination of releasable 2，4，6-trichloroanisol（TCA）:ISO 20752-2007［S］.Switzerland: ISO Copyright Office，2007.

［10］Zhang Z，Pawliszyn J.Headspace solid-phase microextraction ［J］.Analytical Chemistry，1993，65（14）：1843-1852.

［11］Riu M，Mestres M，Busto O，et al.Quantification of chloroanisoles in cork using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography with electron capture detection［J］.Journal of Chromatography A，2006，1107（1）：240-247.

［12］Lizarraga E，Irigoyen A，Belsue V，et al.Determination of chloroanisole compounds in red wine by headspace solidphase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2004，1052 （1）：145-149.

［13］张哲琦，牟德华，李艳.优化GC检测2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）的萃取条件［J］.食品工业科技，2014（2）：89-95

［14］Peña-Neira A，de Simón B F，García-Vallejo M C，et al.Presence of cork-taint responsible compounds in wines and their cork stoppers［J］.European Food Research and Technology，2000，211（4）：257-261.

［15］Rodrıguez-Bencomo J J，Conde J E，Rodrıguez-Delgado MA，et al.Determination of esters in dry and sweet white wines by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2002，963 （1）：213-223.

［16］Hennion M C.Solid-phase extraction: method development，sorbents，and coupling with liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1999，856（1）：3-54.

［17］Poole C F.New trends in solid-phase extraction［J］.TrAC Trends in Analytical Chemistry，2003，22（6）：362-373.

［18］Insa S，Anticó E，Ferreira V.Highly selective solid-phase extraction and large volume injection for the robust gas chromatography-mass spectrometric analysis of TCAand TBAin wines［J］.Journal of Chromatography A，2005，1089 （1）：235-242.

［19］Slabizki P，Schmarr H G.Analysis of corky off-flavour compounds at ultra trace level with multidimensional gas chromatography-electron capture detection［J］.Journal of Chromatography A，2013，1271（1）：181-184.

［20］Vlachos P，Kampioti A，Kornaros M，et al.Matrix effect during the application of a rapid method using HS-SPME followed by GC-ECD for the analysis of 2，4，6-TCAin wine and cork soaks［J］.Food Chemistry，2007，105（2）：681-690.

［21］Riu M，Mestres M，Busto O，et al.Comparative study of two chromatographic methods for quantifying 2，4，6-trichloranisole in wines［J］.Journal of Chromatography A，2007，1138（1）：18-25.

［22］Carasek E，Cudjoe E，Pawliszyn J.Fast and sensitive method to determine chloroanisoles in cork using an internally cooled solid-phase microextraction fiber［J］.Journal of Chromatography A，2007，1138（1）：10-17.

［23］Jönsson S，Uusitalo T，van Bavel B，et al.Determination of 2，4，6-trichloroanisole and 2，4，6-tribromoanisole onng L-1 to pg L-1 levels in wine by solid-phase microextraction and gas chromatography-high-resolution mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2006，1111（1）：71-75.

［24］Liu M，Peng Q，Chen Y，et al.Arapid space-resolved solidphase microextraction method as a powerful tool to determine contaminants in wine based on their volatility［J］.Food Chemistry，2015，176：12-16.

［25］Tang S，Lin X H，Li S F Y，et al.In-syringe dispersive solidphase extraction using dissolvable layered double oxide hollow spheres as sorbent followed by high-performance liquid chromatography for determination of 11 phenols in river water［J］.Journal of Chromatography A，2014：31-39.

［26］Patil S H，Banerjee K，Utture S C，et al.Development and validation of a simple analytical method for the determination of 2，4，6-trichloroanisole in wine by GC-MS［J］.Food Chemistry，2011，124（4）：1734-1740.

［27］Ezquerro O，Ortiz G，Pons B，et al.Determination of benzene，toluene，ethylbenzene and xylenes in soils by multiple headspace solid-phase microextraction［J］.Journal of Chromatography A，2004，1035（1）：17-22.

［28］Ezquerro Ó，Tena M T.Determination of odour-causing volatile organic compounds in cork stoppers by multiple headspace solid-phase microextraction［J］.Journal of Chromatography A，2005，1068（2）：201-208.

［29］Maggi L，Zalacain A，Mazzoleni V，et al.Comparison of stir bar sorptive extraction and solid-phase microextraction to determine halophenols and haloanisoles by gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry［J］.Talanta，2008，75（3）：753-759.

［30］Ghiasvand AR，Hosseinzadeh S，Pawliszyn J.New coldfiber headspace solid-phase microextraction device for quantitative extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment［J］.Journal of Chromatography A，2006，1124（1）：35-42.

［31］Baltussen E，Sandra P，David F，et al.Stir bar sorptive extraction（SBSE），a novel extraction technique for aqueous samples: theory and principles［J］.Journal of Microcolumn Separations，1999，11（10）：737-747.

［32］Callejon R M，Troncoso AM，Morales M L.Analysis for chloroanisoles and chlorophenols in cork by stir bar sorptive extraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］.Talanta，2007，71（5）：2092-2097.

［33］Cacho J I，Campillo N，Viñas P，et al.Stir bar sorptive extraction polar coatings for the determination of chlorophenols and chloroanisoles in wines using gas chromatography and mass spectrometry［J］.Talanta，2014，118：30-36.

［34］Vestner J，Fritsch S，Rauhut D.Development of a microwave assisted extraction method for the analysis of 2，4，6-trichloroanisole in cork stoppers by SIDA-SBSE-GC-MS［J］.Analytica chimica acta，2010，660（1）：76-80.

［35］MARTENDAL E，BUDZIAK D，CARASEK E.Application of fractional factorial experimental and box-behnken designs for optimization of single-drop microextraction of 2，4，6-tricholoroanisole and 2，4，6-tribromoanisole from wine samples［J］.Journal of Chromatography A，2007，1148：131-136.

［36］Dupont J，de Souza R F，Suarez PAZ.Ionic liquid（molten salt）phase organometallic catalysis［J］.Chemical Reviews，2002，102（10）：3667-3692.

［37］Márquez-Sillero I，Aguilera-Herrador E，Cárdenas S，et al.Determination of 2，4，6-tricholoroanisole in water and wine samples by ionic liquid-based single-drop microextraction and ion mobility spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2011，702（2）：199-204.

［38］Yiantzi E，Psillakis E，Tyrovola K，et al.Vortex-assisted liquid-liquid microextraction of octylphenol，nonylphenol and bisphenol-A［J］.Talanta，2010，80（5）：2057-2062.

［39］Pizarro C，Pérez-del-Notario N，Sáenz-Mateo A，et al.A simple and sensitive vortex assisted liquid-liquid microextraction method for the simultaneous determination of haloanisoles and halophenols in wines［J］.Talanta，2014，128：1-8.

［40］Zgoła-Grześkowiak A，Grześkowiak T.Dispersive liquidliquid microextraction［J］.TrAC Trends in Analytical Chemistry，2011，30（9）：1382-1399.

［41］Pizarro C，Sáenz-González C，Pérez-del-Notario N，et al.Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the simultaneous determination of the main compounds causing cork taint and Brett character in wines using gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218（12）：1576-1584.

［42］Extraction III S P，Berezkin V G，Drugov Y S，et al.Pressurized Fluid Extraction［J］.Mass Spectrometry，2000，35 （568）：572.

［43］Ezquerro Ó，Garrido-López Á，Tena M T.Determination of 2，4，6-trichloroanisole and guaiacol in cork stoppers by pressurised fluid extraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2006，1102（1）：18-24.

［44］Regueiro J，Llompart M，Garcia-Jares C，et al.Ultrasoundassisted emulsification-microextraction of emergent contaminants and pesticides in environmental waters［J］.Journal of Chromatography A，2008，1190（1）：27-38.

［45］Saleh A，Yamini Y，Faraji M，et al.Ultrasound-assisted emulsification microextraction method based on applying low density organic solvents followed by gas chromatography analysis for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216（39）：6673-6679.

［46］Pizarro C，Sáenz-González C，Pérez-del-Notario N，et al.Ultrasound-assisted emulsification-microextraction for the sensitive determination of Brett character responsible compounds in wines［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218（50）：8975-8981.

［47］Fontana AR，Patil S H，Banerjee K，et al.Ultrasound-assisted emulsification microextraction for determination of 2，4，6-trichloroanisole in wine samples by gas chromatography tandem mass spectrometry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（8）：4576-4581.

［48］Blanch G P，Reglero G，Herraiz M.Analysis of wine aroma by off-line and online supercritical fluid extraction-gas chromatography［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43（5）：1251-1258.

［49］Hedrick J L，Mulcahey L J，Taylor LT.Supercritical fluid extraction［J］.Microchimica Acta，1992，108（3-6）：115-132.

［50］Taylor M K，Young T M，Butzke C E，et al.Supercritical fluid extraction of 2，4，6-trichloroanisole from cork stoppers［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（6）：2208-2211.

［51］Hill Jr H H，Siems W F，St Louis R H.Ion mobility spectrometry［J］.Analytical Chemistry，1990，62（23）：1201A-1209A.

［52］Quimby B D，Sullivan J J.Evaluation of a microwave cavity，discharge tube，and gas flow system for combined gas chromatography-atomic emission detection［J］.Analytical Chemistry，1990，62（10）：1027-1034.

［53］Campillo N，Aguinaga N，Viñas P，et al.Purge-and-trap preconcentration system coupled to capillary gas chromatography with atomic emission detection for 2，4，6-trichloroanisole determination in cork stoppers and wines［J］.Journal of Chromatography A，2004，1061（1）：85-91.

［54］Peres AM，Freitas P，Dias L G，et al.Cyclic voltammetry:A tool to quantify 2，4，6-trichloroanisole in aqueous samples from cork planks boiling industrial process［J］.Talanta，2013，117：438-444.

［55］Lichvanová Z，Ilbeigi V，Sabo M，et al.Using corona discharge-ion mobility spectrometry for detection of 2，4，6-Trichloroanisole［J］.Talanta，2014，127：239-243.

［56］Apostolou T，Pascual N，Marco M，et al.Extraction-less，rapid assay for the direct detection of 2，4，6-trichloroanisole（TCA）in cork samples［J］.Talanta，2014，125：336-340.

［57］Moore E，Pravda M，Guilbault G G.Development of a biosensor for the quantitative detection of 2，4，6-trichloroanisole using screen printed electrodes［J］.Analytica Chimica Acta，2003，484（1）：15-24.

［58］Pereira C，Gil L，Carriço L.Reduction of the 2，4，6-trichloroanisole content in cork stoppers using gamma radiation［J］.Radiation Physics and Chemistry，2007，76（4）：729-732.

［59］Vlachos P，Stathatos E，Lyberatos G，et al.Gas-phase photocatalytic degradation of 2，4，6-trichloroanisole in the presence of a nanocrystalline Titania film.Applications to the treatment of cork stoppers［J］.Catalysis Communications，2008，9（10）：1987-1990.

Research Progress in New Detection Technology of 2，4，6-Trichloroanisole in Grape Wine

ZHOU Lihua1，MOU Dehua1and LI Yan1，2
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Hebei Provincial R&D Center for Fermentation Engineering，Shijiazhuang，Hebei 050018，China）

Abstract:2，4，6-trichloroanisole（TCA）is a substance harmful to wine sensory quality.It usually comes from wine corks，and possibly comes from grape or wine-making process contamination.Its existence results in bad odor and bad taste in wine.In this paper，the new methods and instruments for the detection of TCA in wine in recent years were introduced including the extraction technology and detection technology of TCA in wine.And the characteristics，principles and application advantages of these new technologies were elaborated for the purpose of providing useful reference for achieving high-precision，low-detection-limit and high-sensitivity qualitative and quantitative determination of TCA in wine，further monitoring TCAin wine，and ultimately improving wine quality.

Key words:2，4，6-trichloroanisole（TCA）；wine；extraction；detection；new technology

中图分类号：TS262.6；TS261.4；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）06-0108-09

DOI：10.13746/j.njkj.2016016

基金项目：河北省食品药品监督管理局2015年度食品药品安全科技项目资助；项目名称：葡萄酒中氯苯甲醚类物质监控技术研究；项目编号：ZD2015014。

收稿日期：2016-01-19

作者简介：周立华（1988-），男，发酵工程专业，在读硕士研究生。

通讯作者：李艳（1958-），女，教授，河北省发酵工程重点学科学术带头人，河北省发酵工程技术研究中心学术带头人，研究方向：传统发酵工程创新技术研究、葡萄酒和果酒酿造。