猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断方法研究进展

文/山东绿都生物科技有限公司　张文通

猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断方法研究进展

文/山东绿都生物科技有限公司张文通

山东绿都生物科技有限公司 山东省滨州畜牧兽医研究院 魏 凤 王金良 沈志强

猪胸膜肺炎是引起呼吸系统疾病的重要传染病之一，严重危害养猪业的健康发展。正确诊断猪胸膜肺炎病对防制本病极为关键。文章就本病病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断3方面展开阐述。

猪胸膜肺炎；诊断方法；研究进展

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起的猪的、以急性出血性和慢性的纤维素性胸膜肺炎病变为特征的一种严重的呼吸系统传染病［1］。本病广泛存在于全世界所有的养猪国家，特别是对现代集约化养猪危害更大，是影响现代养猪业发展的重大疫病之一。本病可依据流行病学调查、临床症状及剖检时病理变化做出初步诊断。但随着集约化养猪业的发展，猪病越来越复杂，仅靠传统诊断方法对该病诊断已显得较为困难，进一步确诊必须依靠实验室诊断。自1978年首次分离该病的病原以来，国内外学者对本病的诊断方法进行了大量研究，取得了显著的成绩。本文就本病实验室诊断方法进展方面，进行了如下综述。

1　细菌分离鉴定

无菌采取病死猪的肺脏病变组织块或急性死亡猪的心血、胸水以及鼻腔血色分泌物，立即接种培养基［2］。37℃培养过夜，观察结果。典型的胸膜肺炎放线杆菌菌落为黏液型蜡样菌落。革兰氏染色镜检为革兰氏阴性，两极着染略深的小球杆菌。胸膜肺炎放线杆菌对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和果糖发酵产酸，尿酸酶试验为阳性［3］。胸膜肺炎放线杆菌在金黄色葡萄球菌菌株培养物接种可形成卫星现象，即NAD生长依赖株。胸膜肺炎放线杆菌为典型的β溶血。将待检菌株培养物直接与标准分型血清做活菌凝集检查，可进行菌株血清定型。

细菌分离鉴定方法优点为病原学诊断最可靠，缺点是耗时长。

2　补体结合试验（Complement Fixation Test， CFT）

1971年Nicolet建立了CFT方法，该方法在国际上被公认为检测APP的标准方法［4］。

Lombin等于1982年改良了Nicolet的方法。其基本操作程序为：超声波处理细菌，收集上清作为抗原；待检血清56℃灭活后加入补体，再加入抗原，反应过夜；第2d加入小牛血清（溶血素）和绵羊红细胞（SRBCs）。如果被检血清中含特异抗体，则抗原抗体复合物结合补体而不出现溶血，呈阳性反应；反之，补体和溶血素与SRBCs结合，则出现溶血，呈阴性反应。

1990年朱士盛等通过将多种血清型抗原以一定比例混合成全细胞抗原冻干后应用，其抗原稳定，改良补体结合试验更适合猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断。

CFT的优点是敏感性高和特异性强，缺点是操作繁锁、费时、成本高，且检测样品不易标准化，一般只能在实验室进行。

3　酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）

自Nicolet等于1981年首次建立检测APP的ELISA方法以来，随后以不同抗原（如荚膜、脂多糖、外膜蛋白等）包被建立的ELISA方法也得以应用。国外已有商品化的ELISA试剂盒，敏感性和特异性较高。该方法可替代CEF作为APP的分型方法。

4　凝集试验 （Agglutination Assay， AA）

凝集试验是一种简单快速检测APP，并可用于血清型分型的方法。凝集试验包括试管凝集、玻片凝集、协同凝集等。

Rapp等比较玻片凝集试验与间接荧光抗体试验发现，玻片凝集试验比间接荧光抗体试验的特异性和敏感性高。Mittal等比较了各种凝集试验发现，协同凝集试验和2-巯基乙醇试管凝集试验的特异性与敏感性均优于玻片凝集试验和试管凝集试验。Habrun等比较2-巯基乙醇微量凝集试验与ELISA试验发现，2-巯基乙醇微量凝集试验适合于早期感染检测，ELISA试验对老龄猪群的检测较2-巯基乙醇微量凝集试验敏感性高。

虽然快速平板凝集试验和协同凝集试验的敏感性不及酶联免疫吸附试验，但它们快速、简便，因而也成为实验室划分APP的常规方法。

5　间接血凝试验（Indirect Hemagglutination Test，IHA）

Mittal等建立了IHA用于检测APP并对其进行血清分型。Nielson报道，IHA在血清型6和8之间有交叉反应，但能区分4型和7型。Pat Blackall应用本方法发现，仍不能区分血清型6和8及血清型9和11。然而，由于此方法操作简便，目前已成为主要的检测和分型方法。

6　间接荧光抗体试验 （Indirect Fluorescence Antibody Test， IFA）

Rosendal等用IFA对APP进行检测与血清学分型。试验发现，除血清型6与非对应的抗血清发生交叉反应外，血清型4与7之间及血清型4与5之间均发生交叉反应。另外还发现，IFA试验不能检测血清型1。总之，间接荧光抗体试验的敏感性和特异性相对较低，在实际中应用也较少。

7　乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test， LAT）

LAT是一种简捷快速的检测方法，不仅可用于检测，亦可用于血清分型。

Inzana用同型无荚膜突变菌对有荚膜菌的抗血清进行吸附，然后用处理过的抗血清致敏乳胶。试验结果表明，该方法特异性好、敏感性高，且简捷、快速，适合在生产中应用。

8　免疫扩散试验（Immunodiffusion Test，IDT）

这是一种经典的免疫学方法。1979年，Gunnarsson等将这种方法用于APP检测，并用于血清分型。该试验有较好的型特异性，是1986 年国际嗜血杆菌胸膜肺炎研究协作组推荐的方法之一。

李开玉等用酚水抗原检测血清，发现特异性最高，但仍不能区分血清型1和9，血清型3、6和8。Blackall等用该方法检测APP时，血清型15与7之间也有交叉反应。

该方法虽然简单，但耗时较长，在孔周围的沉淀线有的很难解释，并且结果可能不明显。Gunnarson等建议用试管凝集试验代替免疫扩散试验来确定APP的血清型。然而，由于每种特异的抗原-抗体复合物均可形成明显的沉淀线，所以免疫扩散试验是研究APP出现附加抗原的有效方法。

9　沉淀试验 （Precipitation Test）

Mittal等建立了环状沉淀试验，用于检测APP及血清分型，结果稳定，重复性较好，而且该方法可以对凝集试验不能确定血清型的APP进行分型。Mittal等建议环状沉淀试验可取代试管凝集试验作为常规的实验室确定APP血清型的方法。但Mittal等认为环状沉淀试验所需试剂较多，应用不便。Hommez等用APP的可溶性抗原建立了玻片沉淀试验，这种方法具有与环状沉淀试验相同的特异性，但操作上比环状沉淀试验简单。

10　聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）

随着分子生物学的发展，PCR技术越来越多地应用于疾病病原地诊断。目前国内外已经建立了多种用于诊断APP的PCR方法，这些方法的敏感性和特异性均较高，且耗时短。国外已研制了一种商品化的APP PCR诊断试剂盒，可以直接用于病料中APP的检测。

PCR方法除应用于感染动物的快速诊断外，还可用于APP的分型。与常规的血清学分型方法相比，这种分子生物学的分型方法快速、简便，但也存在交叉反应［6］。因此，将分子生物学的分型方法与常规血清学方法相结合，无疑会提高分型的速度和准确性［7，8］。■

［1］ 白文彬，于康震.动物传染病诊断学［M］.北京：中国农业出版社，2002，476～482.

［2］ 杜宗沛，解慧梅，吴植，等.猪放线杆菌性传染性胸膜肺炎的诊断与预防［J］.中国兽医杂志，2010，46（11）：78～79.

［3］ 陈慧.锦州地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定［J］.安徽农业科学，2012，40（6）：3366～3367.

［4］ 余燕，马金友，王天有，等.猪接触传染性胸膜肺炎的诊治［J］.河南农业科学，2007（8）：107～112.

［5］ 陈小玲，杨旭夫，朱士盛，等.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施［J］.中国兽医杂志，2001（7）：33～35.

［6］ 吕素芳，郭广君，唐娜，等.猪胸膜肺炎放线杆菌分子生物学研究进展［J］.中国人兽共患病学报，2011（27）：574～577.

［7］ 徐公义，王海丽，刁有祥，等.猪传染性胸膜肺炎血清型与溶血毒素型的调查［J］.中国兽医杂志，2008，44（6）：37～38.

［8］ 华云龙，张应国，钟南，等.云南猪传染性胸膜肺炎血清抗体调查［J］.动物检疫，1992，9（3）：27.

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队SDAIT-06-011-14。