黄芪注射液通过调节JNK和NF-κB通路抑制视网膜神经节细胞凋亡*

谷新怡，周 剑，闫晓玲，苏 艳，吴鲁华，赵朋波，刘昕妍

(1.北京中医药大学，北京 100029;2.北京中医药大学东方医院，北京 100078; 3.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)

黄芪注射液通过调节JNK和NF-κB通路抑制视网膜神经节细胞凋亡*

谷新怡1，周 剑2△，闫晓玲2，苏 艳2，吴鲁华3，赵朋波1，刘昕妍1

(1.北京中医药大学，北京 100029;2.北京中医药大学东方医院，北京 100078; 3.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)

目的:观察黄芪注射液对视神经牵拉伤大鼠视神经保护作用并探讨其作用机制。方法:将66只SPF级健康Wistar雄性大鼠按随机数字表法分为假手术组、视神经牵拉伤模型组及黄芪注射液治疗组3组各22只大鼠;横向定量牵拉法制作大鼠视神经损伤模型，假手术组仅暴露视神经不予牵拉;术后治疗组给予黄芪注射液腹腔注射，模型组给予生理盐水腹腔注射;治疗14 d后取大鼠视网膜组织，利用蛋白免疫印迹法检测JNK和NF-κB表达变化，并采用real time-PCR方法检测p75NTR的mRNA水平。结果:与假手术组比较，视神经牵拉伤模型大鼠视网膜组织p75NTR mRNA水平及JNK蛋白表达明显上升，NF-κB蛋白表达显著下降;给药14 d后与模型组比较，黄芪注射液治疗组大鼠视网膜组织p75NTR mRNA水平及JNK蛋白表达显著减少，NF-κB蛋白表达明显升高。结论:黄芪注射液具有视神经保护作用，其机制可能与抑制p75NTR mRNA的表达及JNK蛋白水平、促进NF-κB的蛋白表达有关。

视神经损伤;黄芪;p75神经营养因子受体;c-Jun氨基末端激酶;核因子κB

视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)是视网膜的第三级神经元，其轴突汇集成视神经，将视觉信号输入大脑，在视觉通路中起重要传导作用;视神经损伤后RGCs数目进行性减少，是导致视功能不可逆性损害的组织病理学基础。在神经元凋亡过程中，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-termianl kinase，JNK)和核因子 кB(nuclear factorkappaB，NF-кB)的表达起至关重要的作用。黄芪注射液是由中药黄芪提取精炼而成，现代药理研究表明，黄芪具有抗氧化、清除氧自由基、保护神经细胞等作用，近年来在视神经保护研究领域中广泛应用。本课题组前期实验证实［1］，黄芪注射液对大鼠视网膜神经节细胞凋亡有抑制作用，但是通过哪条信号传导通路发挥抑制凋亡作用目前尚不清楚。本研究通过观察黄芪注射液对视神经牵拉伤大鼠视网膜神经节细胞凋亡相关蛋白JNK及 NF-кB表达的影响，探讨黄芪注射液抑制细胞凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

1.1.1 动物与分组 选择健康SPF级成年雄性Wistar大鼠66只，体质量(220±20)g，购自北京维通利华实验动物有限公司。行外眼及眼底检查，无眼疾者纳入实验，实验期间于北京中医药大学东方医院实验中心饲养，自由摄食、饮水，室内通风干燥。按随机数字表法分为假手术组22只，模型组即视神经牵拉伤+生理盐水组22只及黄芪治疗组即视神经牵拉伤+黄芪注射液组22只。假手术组仅暴露视神经，不予牵拉，不予任何药物，模型组和治疗组均选取左眼制作视神经损伤模型，右眼为正常对照。

1.1.2 药物及主要试剂 黄芪注射液购自杭州正大青春宝药业有限公司(批准文号国药准字Z33020179)。RNAisoTMPlus提取试剂(D9108A)、SYBR Premix Taq II(2×)(DRR081S)购自TaKaRa; ReverTra Ace-α-反转录试剂盒 (FSK-100)购自TOYOBO公司;兔抗JNK抗体(9258S)、小鼠抗NF-кB 抗 体 (6956S)均 购 自 美 国 CellSignaling Technology公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记 anti-Rabbit抗体(ZB-2301)购自北京中杉金桥;辣根过氧化物酶(HRP)标记anti-Mouse抗体(7076S)购自Cell Signaling Technology公司;RI-PA 裂解液(R0010)、BCA法蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)及ECL超敏发光液(PE0010)均购自北京索莱宝科技有限公司。普通PCR仪器(型号MG96+)为杭州朗基科学仪器有限公司产品，荧光 PCR仪(型号ABI7500)为美国ABI公司产品，SDS-PAGE电泳设备均为美国BioRad公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 模型复制 采用横向定量牵拉法制作视神经损伤模型大鼠［2-3］:术前直接检眼镜查大鼠眼底视网膜及血管无异常。2%戊巴比妥(按100 mg/kg大鼠体质量)腹腔注射全身麻醉动物，大鼠俯卧位，沿大鼠左眼颞侧眶缘剪开皮肤长约1 cm，摘除部分眶脂肪，剪断(亦可保留)上直肌和外直肌，向眶尖部钝性分离并暴露视神经，采用6-0聚酯缝合线在球后1～2 mm处圈住视神经并打结(圈长等于视神经横截面周长，注意不能拉紧)，缝线另一头连接压力张力计(最小刻度0.01 N)，以0.10 N拉力垂直于视神经水平牵拉并持续20 s。牵拉完成后立即观察，如大鼠术眼瞳孔散大、直接对光反射消失、间接对光反射存在、眼底视网膜无血管闭塞、视网膜苍白缺血不超过5 min予以纳入，否则予以淘汰。术后缝合伤口，常规抗炎，回笼饲养。造模后第2天开始分组腹腔注射药物进行干预。

1.2.2 给药方法 治疗组于造模成功后1 d开始给予黄芪注射液腹腔注射0.5 ml/d×14 d，模型组于造模成功后1 d开始给予0.9%氯化钠注射液腹腔注射0.5 ml/d×14 d。

1.2.3 取材 假手术组、模型组及黄芪治疗组均于造模后第15天取材。10%水合氯醛过量麻醉处死大鼠，剪开睑裂，完整摘取双眼眼球置于冰上操作，沿角膜缘剪开去除晶体和玻璃体，小心剥离视网膜置于冻存管中，立即投入液氮中保存。

1.2.4 指标检测

①Western blot检测视神经牵拉伤大鼠视网膜组织JNK、NF-кB蛋白表达:取视网膜组织，每4个视网膜为1个样本(约40 mg)，采用冰浴超声裂解组织，BCA法测定蛋白浓度，每孔上样50 μg进行SDS-PAGE电泳，转印蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，10%脱脂奶粉封闭，一抗4℃过夜(anti-JNK 1∶1000稀释，anti-NF-кB 1∶1000稀释，anti-GAPDH 1∶2000稀释)，辣根酶标记二抗(1∶3000稀释)，ECL发光液显影、曝光并拍照。条带灰度值分析采用Alpha View软件测定，计算目标蛋白灰度值/内参灰度值。②Real-time PCR检测神经牵拉伤大鼠视网膜组织p75NTR mRNA表达:取视网膜组织，采用 RNAisoTMPlus提取试剂抽提各组总RNA，按照ReverTra Ace-α-反转录试剂盒说明书进行逆转录。GenBanK上查找相关的基因序列，特异性引物由life technologies公司设计合成。P75NTR上游引物:5’-CCACCAGAGGGAGAGAAAC TG-3’，下游引物:5’-CCAGGTGTCACCATTGAGC AG-3’，扩增目标:186 bp。beta-actin上游引物:5’-CTTCCTTCTTGGGTA TGGAATCC-3’，下游引物:5’-GGAGCAATGATC TTGATCTTCATG-3’，扩增目标: 205 bp。实时定量 PCR反应条件:预变性94℃ 10 min，94℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 15s，80℃ 30 s，循环40次，读取 Ct(cycle threshold)值，首先分别计算各样本目的基因p75NTR与内参beta-actin Ct的差值，即△Ct=Ct(p75NTR)－Ct(beta-actin)，再用各处理样本的△Ct减去对照组的△Ct，得到△△Ct，即［Ct (处理组目的基因)－Ct(处理组内参基因)］－［Ct (对照组目的基因)－Ct(对照组内参基因)］，利用2－△△Ct进行计算［4］，表示实验组测定基因 p75NTR的表达相对于正常对照组样本 p75NTR表达的变化倍数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，数据均符合正态分布且方差齐采用单因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)，组间比较用 LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠视网膜组织JNK蛋白表达的影响

鉴于以上我区的水果包装中存在的问题来看，未来水果包装的发展趋势应当顺应国家环保的号召，走绿色环保型的道路，要采用绿色环保的材料进行包装，对于那些化学物质严重超标的包装物要尽量避免使用，以免造成对环境的破坏和对人体健康的危害。但是在低碳环保的同时，也要做到节约资源，保证产品的质量，降低包装资源的损耗率。只有这样，才能做到资源的可持续利用和发展。

图1表1显示，与假手术组比较，视神经牵拉伤模型大鼠视网膜组织 JNK明显上升，组间方差齐同，经单因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)显示(P=0.008＜0.05)。给药 14 d后与模型组比较，黄芪注射液治疗组大鼠视网膜组织 JNK蛋白表达明显下降(P=0.003＜0.05)，说明中药黄芪可以明显下调大鼠视网膜组织 JNK的蛋白表达，且差异有统计学意义。

图1 各组大鼠视网膜组织JNK表达的Western blot电泳条带

表1 各组大鼠视网膜组织JNK蛋白表达的情况(±s)

表1 各组大鼠视网膜组织JNK蛋白表达的情况(±s)

注:与假手术组(左眼)比较:*P=＜0.05;与模型组(左眼)比较:△P＜0.05

组别 鼠数JNK/GAPDH模型 组 ( 右 眼 )4 0.032 0.57±0.09模 型 组 ( 左 眼 ) 4 0.77±0.08*治 疗 组 ( 右 眼 ) 4 0.56±0.10治 疗 组 ( 左 眼 ) 4 0.52±0.12△假 手 术 组 (右 眼 ) 4 0.55±0.10假 手 术 组 (左 眼 ) 4 0.55±0.10 F 3.149 P

2.2 对大鼠视网膜组织NF-кB蛋白表达影响

图2表2显示，与假手术组比较，视神经牵拉伤模型大鼠视网膜组织 NF-кB明显下降，组间方差齐同，经单因素方差分析(One-Way ANOVALSD)显示(P=0.002＜0.05)。给药14 d后与模型组比较，黄芪注射液治疗组大鼠视网膜组织NF-кB蛋白表达明显上调(P=0.003＜0.05)，说明中药黄芪可以明显改善大鼠视网膜组织 NF-кB的蛋白表达，且差异有统计学意义。

图2 各组大鼠视网膜组织NF-кB表达的Western blot电泳条带

2.3 对大鼠视网膜组织 p75NTR mRNA表达的调节作用

表3显示，各组间方差齐同，经单因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)，模型组p75NTR mRNA表达较假手术组升高(P=0.000)，假手术组的表达仅为模型组的0.23倍。黄芪注射液治疗组的p75NTR mRNA表达较模型组降低(P=0.04)，治疗组的表达为模型组的0.56倍。

表2 各组大鼠视网膜组织NF-кB蛋白表达的情况(±s)

表2 各组大鼠视网膜组织NF-кB蛋白表达的情况(±s)

注:与假手术组(左眼)比较:*P＜0.05;与模型组(左眼)比较:△P＜0.05

组别 鼠数 NF-кB/GAPDH模型组 ( 右 眼 )4 0.001 0.82±0.05模 型 组 ( 左 眼 ) 4 0.63±0.06*治 疗 组 ( 右 眼 ) 4 0.81±0.06治 疗 组 ( 左 眼 ) 4 0.80±0.06△假 手 术 组 (右 眼 ) 4 0.83±0.05假 手 术 组 (左 眼 ) 4 0.82±0.06 F 7.274 P

表3 p75NTR mRNA的表达情况(相对定量法)

3 讨论

P75神经营养因子受体 (p75 neurotrophin receptor，p75NTR)因其促神经元细胞凋亡的效应近年得到广泛研究［5-6］。p75NTR是一种跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员之一［7］。TNF受体家族在氨基酸排序上有很大的保守性，它们的胞内域都存在一个短的同源区域，称为死亡结构域(death domain)，当它与配基结合时可诱导相应细胞发生凋亡。Lebrun-Julien等［8］进一步对 Müller细胞进行研究发现，神经营养因子(NGF)与P75NTR受体结合后产生了对RGCs有害的毒性信号，可抵消NFG的神经保护作用;此外，即使不使用NGF，药物抑制p75NTR或者使用敲除p75NTR基因的小鼠也可减少轴索断裂造成的 RGCs死亡，进一步证实p75NTR的毒性作用。通过对p75NTR信号传导途径的研究发现，一些信号分子参与 p75NTR引起的细胞凋亡过程，如神经酰胺(ceramide)、JNK (c-Jun N-termianl kinase)、Bax、caspase、calpain等。研究表明，神经酰胺可以激活JNK，JNK活化后可与线粒体共同产生促凋亡作用，因此 JNK的活化在p75NTR介导的细胞凋亡中起重要作用［9-10］。

需要指出的是，p75NTR也可通过核因子 кB (nuclear factor kappaB，NFкB)促进 RGCs细胞存活。NF-κB是 p75NTR参与促进 RGCs细胞存活的重要信使，自然状态下 NF-κB普遍存在于细胞浆中，与其抑制性蛋白 IκB结合而呈非活性状态。当机体受到创伤如被病毒、氧化剂、炎症细胞因子等刺激后，NF-κB被激活与 IκB解离，从胞浆中进入到细胞核内，结合到靶基因启动子序列上的 κB位点，诱导基因转录，合成各种细胞因子，并通过反馈环路将基因表达放大、持续。NF-κB与细胞凋亡的关系十分密切。一方面 NF-κB能通过刺激IL-1β转化酶蛋白酶、c-myc、TNF-α基因的表达而诱导细胞凋亡。同时又有大量的证据表明，NF-κB在活体和不同的细胞培养模型中均有抗凋亡作用［11-12］。

黄芪注射液是由中药黄芪提取精制而成，黄芪始载于《神农本草经》，为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. Var.mongholicus(Bge.)Hsia或 膜 荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，其味甘、性温，有补气升阳、固表止汗、托毒排脓和生肌等功效［13］。现代药理研究发现，黄芪具有增强心肌收缩力、保护心肌细胞、清除氧自由基、改善微循环灌注、提高超氧化物歧化酶活性、调节免疫功能、降低血液黏稠度、抑制血小板凝聚等作用［14］。临床广泛用于治疗循环、神经、呼吸和内分泌等疾病。近年来，黄芪在缺血性视网膜病变、青光眼和糖尿病视网膜病变等眼科疾患中的应用也日益广泛。

本实验以横向定量牵拉法制作大鼠视神经损伤模型，从基因和蛋白水平观察黄芪注射液对视神经牵拉伤大鼠视网膜组织 p75NTR、JNK及NF-кB的影响。实验证实，在视神经损伤之后，模型组手术眼JNK蛋白表达量明显高于非手术眼，这提示横向牵拉法造模导致的视神经节细胞凋亡通过 JNK蛋白介导。黄芪注射液治疗组p75NTR的mRNA及JNK的蛋白表达水平均较模型组降低，而NFкB蛋白表达量较模型组明显升高，提示黄芪注射液可以降低视神经牵拉伤大鼠视网膜组织中p75NTR mRNA的表达，从而减少神经生长因子与p75NTR的结合，进而阻断下游JNK信号传导通路的激活，发挥抗细胞凋亡的作用，并通过上调NF-кB的蛋白表达而促进神经再生，从而提高神经元的抗损伤能力，起到视神经保护作用。

［1］廖良，孔莹莹，韦企平，等.黄芪注射液对体外培养视网膜神经节细胞的保护作用［J］.眼科新进展，2010，12:1101-1104.

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Astragalus Injection Inhibits Retinal Ganglion Cell Apoptosis by Regulating JNK and NF-κB Pathway

GU Xin-yi1，ZHOU Jian2△，YAN Xiao-ling2，SU Yan2，WU Lu-hua3，ZHAO Peng-bo1，LIU Xin-yan1
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 3.The Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To observe the optic nerve protective effects of astragalus membranaceus injection on tractive optic nerve injury in rats and to explore its possible mechanism.Methods:66 healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operated group，model group and astragalus membranaceus injection group，with 22 rats in each group; The optic nerve of model rats was injured by the transverse quantitative traction(tension given to the optic nerve:0.10N; tractive direction:perpendicular to the optic nerve;duration:20 seconds)，and that of sham-operation group was only exposed but not pulled;After model establishment，treatment group were given with astragalus membranaceus injection by intraperitoneal injection，and model group were given with normal saline for testing.14 days later，the changes of expression of JNK and NF-κB in rat retinal tissue were detected with Western blotting，and the expression of p75NTR mRNA was detected by real-time PCR.Results:Compared with the sham operation group，the expression level of p75NTR mRNA and JNK protein in the optic nerve injury group increased.On the contrary，the protein expression level of NF-κB significantly declined;After treatment for 14 days，the expression of p75NTR mRNA and JNK protein decreased in the astragalus injection treatment group compared with the model group.However，the protein expression level of NF-κB increased.Conclusion:Astragalus membranaceus injection could has the function of protecting the optic nerve.The mechanism may be related with decreasing p75NTR mRNA and the protein expression of JNK，and increasing the protein expression of NF-κB.

Optic nerve injury;Astragalus membranaceus;P75 neurotrophin receptor;C-Jun N-termianl kinase; Nuclear factor kappaB

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0358-04

2015-06-15

国家自然科学基金资助项目(81173307)-补气活血法对视神经p75NTR/TrK信号通路调控的分子机制研究

谷新怡(1986-)，女，黑龙江人，在读博士，从事中医药治疗视神经疾病的临床与研究。

△通讯作者:周 剑(1964-)，男，教授，主任医师，医学硕士，博士研究生导师，从事中医药治疗视神经疾病的临床与研究，Tel:010-67689733，E-mail:zhj9667@126.com。