益气养阴中药对实验性结核菌感染小鼠细胞因子的影响*

王 波，李邦印，唐仕欢

(1.中国人民解放军309医院，北京 100091;2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

益气养阴中药对实验性结核菌感染小鼠细胞因子的影响*

王 波1，李邦印1，唐仕欢2

(1.中国人民解放军309医院，北京 100091;2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

本项目收集和整理古今防治肺痨的方剂文献，建立肺痨病证方剂数据库，应用基于熵的复杂系统聚堆方法，快速筛选出防治肺痨的中药核心组合，在此基础上对筛选出的益气养阴中药核心组合进行实验验证。实验证明，益气养阴中药能在一定程度上改善结核菌感染的小鼠免疫功能，影响细胞因子，从而间接说明益气养阴中药对结核病有一定疗效。

益气养阴;中药;结核菌感染;细胞因子

肺结核是一种慢性传染性疾病，现代医学认为其发病与机体免疫功能降低有关。中医认为，肺结核相当于中医学的“肺痨”，本病以阴虚为主，气阴两虚贯穿始终。本项目收集和整理古今防治肺痨的方剂文献，建立肺痨病证方剂数据库，应用基于熵的复杂系统聚堆方法，快速筛选出防治肺痨的中药核心组合，并在此基础上对筛选出的益气养阴中药核心组合进行了实验验证。

1 益气养阴中药的筛选及制备

1.1 肺痨方剂数据库设计和建立

查阅《中医方剂大辞典》以及当代中医名家经验集，如《施今墨临床经验集》、《孔伯华医集》、《中国百年百名中医临床家·朱良春》、《中国百年百名中医临床家·邓铁涛》、《中国百年百名中医临床家·任继学》等。主要收集和整理了《中医方剂大辞典》中以肺痨、痨瘵、尸注、鬼注等为主治的方剂，排除属于虚劳、暑瘵等中药方剂。以Epidata 3.1为开发平台，编制计算机程序，使得所有方剂涉及的中药名称都成为二值变量。录入者用鼠标将某一方剂所涉及的中药点击，即把它们赋值为“1”，其他未点击部分则自动赋值为“0”。收录治疗肺痨的方剂477首，其中包括425种常用的中药，建立肺痨方剂数据库。

1.2 防治肺痨药物筛选

应用数学建模方法对肺痨方剂数据库的数据进行挖掘，通过数学方法计算筛选出相关性较大的治疗肺痨的中药核心组合，根据无监督的熵层次聚类法二期分析筛选结果，得到候选药物组合，针对得到的新组合特点，考虑到犀角、麝香等药材珍稀贵重，我们选取其中3个新组合作为一期药理活性筛选的样品进行实验，并制备相应的样品。

1.3 候选药物组合中饮片剂量的确定

为确定候选处方中饮片的剂量及其比例，我们参照2010版《中国药典》规定的饮片用量用法项，以规定的饮片最大剂量进行组方。

1.4 饮片购置及鉴定

候选药物组合中的饮片均购自中国中医科学院中医门诊部，并经中国中医科学院中医门诊部薛庆海副主任药师鉴定确认。

1.5 制备方法

根据中药汤剂的常规煎煮方法，候选处方中鳖甲先煎，其他药物先浸泡30 min后煎煮40 min，水煎2次、混匀，均浓缩至生药量1 g/ml，待冷却后放入－20℃冰箱保存备用(上述处方各取5剂煎煮浓缩，样品1约65×5=325 ml，样品2约63×5=315 ml，样品3约90×5=450 ml)。

表1 用于样品制备的防治肺痨候选方及其剂量、浓度

2 实验研究

培养小鼠腹腔巨噬细胞，建立结核菌感染模型，对3个筛选药方进行血清药理学检测，通过测定TNF-α、IL-2、INF-γ水平，间接推测对治疗结核的疗效。

2.1 含药血清的制备

BALB-C雌性小鼠50只，体质量19～21 g。正常饲养3 d后，观察有无异状，分为对照组和3个药方组各10只，10只备用。分组后小鼠禁食1夜然后灌胃给药。给药分为3个药方，给药剂量为25 g/ kg体质量。第2天灌药2次，间隔4 h，每次进药量0.5 ml/鼠左右。灌药6 h后，摘取眼球取血(不抗凝)，取血清。血样品可直接取用或者－20℃保存。

2.2 腹腔巨噬细胞的培养［1］

在超净工作台操作。消毒脱颈椎处死BABC雌性小鼠，腹部局部消毒，在无菌条件下注射入2 ml RPMI1640细胞培养液，轻柔10次，解剖腹部，用无菌针管吸取腹腔液混匀，并置于离心管中。常温状态下离心15 min弃上清液。将沉淀用RPMI1640细胞培养液或者PBS充分悬浮再离心，方法同上。弃上清液用培养液悬浮，洗1次，离心收集细胞沉淀。

用含10%胎牛血清的 lRPMI1640细胞培养液将沉淀于管底的细胞充分悬浮，并吹打均匀，取100 ul稀释 50倍，以含血清培养液调整细胞浓度为109/ml在显微镜下计数。将上述细胞接种于96孔细胞板，每孔加入200 ul，置于37℃二氧化碳培养箱温育。培养3 d后，观察细胞巨噬细胞贴壁情况换液，然后继续培养2 d后可用于下一步实验。

2.3 不同药方刺激小鼠巨噬细胞分泌细胞因子的鉴定

BACB小鼠50只，均为雌性(购自北京华阜康生物科技股份有限公司);卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG，50 mg/支，约5×106个活菌/mg;冻干粉针剂;热稳定性 62%，上海生物制品研究所)。TNF-α、IL-2及 INF-γ ELISA 试剂盒均由美国eBioscience公司生产。

参照普通结核分枝杆菌的培养方法［2］，在强毒室中培养 BCG，至对数期生长状态，取菌即用于感染模型试验。使用前将50 mg BCG经10 ml无菌、无热原的生理盐水稀释为2.5×107个活菌/ml的 BCG悬液。含药血清及巨噬细胞感染模型的使用参照韩俭［3］、Skinner［4］等学者的方法。

表2～4显示，试验方法:分正常对照组、BCG模型组及不同药方组。正常对照组在无菌操作过程中提取小鼠腹腔巨噬细胞，离心后计数，按每孔加入1×105细胞进行接种，每孔加入等量 BCG，以没有加BCG的细胞孔为正常对照组。简单培养后，加入3种不同药方的血清。加入 BCG没有进行药物处理的为BCG模型组，同时加入BCG和药物的为不同药方组。每种药物的剂量分别为1、5、20 ul。每种剂量做5个平行孔。培养10 h后，取上清液进行不同细胞因子的ELISA测定，操作方法严格按照说明书进行。

表2 药方1对 sIL-2R、TNF-α及INF-γ的影响

表3 药方2对sIL-2R、TNF-α及INF-γ的影响

表4 药方3对sIL-2R、TNF-α及INF-γ的影响

3 讨论

可溶性白介素-2受体 (sIL-2R)是由活化的淋巴细胞及单核细胞产生的多肽，是活化淋巴细胞膜IL-2Rα链成分，由细胞膜脱落进入血液循环中，其增高会使白介素-2(IL-2)对人体的保护作用减弱。sIL-2R影响体内IL-2的机制有2种，一是sIL-2R从细胞膜脱落后降低细胞膜表面的膜白介素-2受体(mIL-2R)数量，使IL-2发挥作用的目标细胞减少，从而间接调节 IL-2的功能;二是 sIL-2R和 mIL-2R竞争结合 IL-2，使 IL-2廓清加速，减轻机体的自分泌效应，从而抑制 T细胞的增殖，减弱 IL-2依赖的免疫应答反应，使IL-2的效应器细胞-NK细胞难以保持其自然杀伤活性，故sIL-2R是重要的免疫抑制物质。

肿瘤坏死因子 α(TNF-α)为前炎细胞因子，由单核巨噬细胞和淋巴细胞产生，TNF-α可上调黏附分子表达，增加同型和异型细胞间黏附作用;促进巨噬细胞活化，增强其吞噬作用;参与肉芽肿形成，从而在结核杆菌感染中起保护作用，然而TNF-α也可导致组织坏死和空洞形成。

γ-干扰素(INF-γ)是由 Th1细胞分泌的免疫调节因子，它能激活单核细胞，使单核细胞在病灶周围积聚，控制感染扩散，有助于接合肉芽肿形成，同时增强巨噬细胞的杀菌作用，在抗结核免疫中起着重要作用。有文献报道，结核病患者的血 INF-γ比健康人明显降低。

本研究 TNF-α的测定中，模型组与正常空白组之间比较差异无统计学意义，但药方3大剂量组与模型组有可比性。药方1、3均能有效降低血清 IL-2R的水平(P＜0.05)，提高 IL-2对机体的保护作用。药方 3亦能显著降低血清中的 TNF-α(P＜0.05)，药方3大剂量组能提高 INF-γ的水平，但与模型组无明显区别，其余方药对INF-γ影响不大。

肺结核是一种慢性传染性疾病，现代医学认为其发病与机体免疫功能降低有关。中医认为，肺结核相当于中医学的“肺痨”，本病以阴虚为主，气阴两虚贯穿始终。处方3由黄芪、人参、五味子、山药、熟地组成，组方原则兼顾益气养阴，能够明显降低细胞因子 IL-2R水平，降低 TNF-α，从而提高免疫功能，侧面说明抗结核的作用;而处方1以养阴作用为主，处方2以滋阴潜阳为主，其组方中未充分考虑肺痨气虚的病机，对细胞因子的作用影响偏小，因而对免疫功能影响不大。本研究对药物的筛选采用了无监督的熵层次聚类法，从而也为治疗其他疾病选取药物提供了方法学的依据。

［1］高鹏，石磊，张润玲.小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴别方法探讨［J］.中国医学检验杂志，2004，10(5):400-402.

［2］谢建平，李瑶，乐军，等.结核杆菌诱导人巨噬细胞肿瘤坏死因子受体相关信号传导元件的表达谱［J］.中华传染病杂志，2003，21(4):256-259.

［3］韩俭，于红娟，吴勇杰，等.中药血清药理学方法学研究—抗菌试验含药血清处理方案的研究［J］.中国药理与临床，2002，18(1):47-48.

［4］Skinner PS，Fumey SK，Jacobs MR，et al.A Bone marrowderived murine macrophage model for evaluating efficacy of antimycobacterial drugs under relevant physiological conditions［J］.antimicrob Agents Chenother，1994，38(11):2557-2563.

Effect of Traditional Chinese Medicine of Supplementing Qi and Nourishing Yin on Cytokines in Mice Infected with Experimental Mycobacterium Tuberculosis

WANG Bo1，LI Bang-yin1，TANG Shi-huan2
(1.The 309th Hospital of PLA，Beijing 100091，China;2 Institute of Chinese Materia Medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Both the traditional and modern prescriptions of preventing and curing lung-asthenia are cited as typical examples in the project，and the research aims at developing a new mode to invent some new traditional Chinese medicine to prevent and cure tuberculosis.with the method of the assembly of complicated system based on entropy，the nuclear combination of variey of traditional Chinese medicine is swifly screened out and tested。The test shows that the traditional Chinese medicine(benefiting vital energy and nourishing yin)would to some extent improve the immune capability of the mouses who have infected the tuberculosis acteria and affect some cytokine.Therefore it demonstrates indirectly that it has some curative effect to tuberculosis.

Benefiting Qi and nourishing yin;Chinese medicine;Tuberculosis infection;Cytokine

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0339-03

2015-07-19

国家自然科学基金资助项目(30873465)-抗痨中药筛选新模式的研究

王 波(1971-)，男，副主任医师，医学博士，从事内分泌系统疾病及结核病的中西医结合临床与研究。