金胺“O”荧光染色LED显微镜检测痰中抗酸杆菌的应用

2016-03-25毛小芳杨敏谢英魏云烁峡江县疾病预防控制中心检验科江西峡江33409新余市妇幼保健院检验科江西新余338000

实验与检验医学 2016年1期

毛小芳，杨敏，谢英，魏云烁(﹑峡江县疾病预防控制中心检验科，江西峡江33409；﹑新余市妇幼保健院检验科，江西新余338000)

毛小芳1，杨敏2，谢英1，魏云烁1
(1﹑峡江县疾病预防控制中心检验科，江西峡江331409；2﹑新余市妇幼保健院检验科，江西新余338000)

摘要：目的探讨金胺“O”荧光染色LED显微镜法在检测痰中抗酸杆菌的应用。方法依据《中国结核病防治规划﹑痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》对2106例痰标本同时用萋-尼氏抗酸染色法和金胺“O”荧光染色法查找抗酸杆菌，比较两种方法的实验结果，分析金胺“O”荧光染色LED显微镜检测抗酸杆菌的灵敏度和特异性。结果2106例痰标本中荧光染色阳性315例，阳性率15.0%；萋-尼氏染色阳性283例，阳性率13.4%，两种方法符合率89.8%。对比两组检测结果，金胺“O”荧光染色LED显微镜法检测的灵敏度和特异性均较高。结论金胺“O”荧光染色LED显微镜法是一种检测灵敏度高﹑特异性好﹑操作简便﹑快速的方法，对结核病患者的早期诊断和治疗具有重要意义。

关键词：荧光染色；LED显微镜；抗酸染色；结核病

中国是全球22个结核病高负担国家之一，目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病人数的14%，位居全球第二位[1]。临床上对于结核病的诊断多使用X线﹑病理切片﹑痰涂片镜检﹑痰培养等，但X线对无典型影像学表现患者有局限性，病理切片耗时长[2]。痰标本直接涂片法操作简单﹑价格低廉，在我国广泛用于肺结核病人的诊断。但传统萋-尼氏抗酸染色法检测时间长，阳性检出率相对较低；金胺“O”荧光染色具有操作简便﹑结果判读方便等优点[3]。本次研究对2106例疑是结核病患者痰标本采用金胺“O”荧光染色LED显微镜和萋-尼氏抗酸染色两种方法同时检测痰标本中抗酸杆菌，进行比较，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1标本来源2106例标本来源于2013年10月至2015年3月江西省峡江县疾控中心结核病防治门诊就诊的疑是肺结核患者，包括初诊患者和复治﹑随访患者。

1.2主要试剂及器材（由全球基金结核病项目提供）结核病荧光法染色液由珠海贝索生物技术有限公司生产，批号414041，有效期20160407。萋-尼氏染色液本实验室按《中国结核病防治规划﹑痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[4]规定方法配制。宁波舜宇EX30LED荧光显微镜。奥林巴斯BA200Inf生物显微镜。青岛海尔HR40-A2生物安全柜。帆船牌清洁﹑无油脂一端磨砂面的新玻片。1.3方法

1.3.1标本处理每份标本涂片2张，一张用于传统萋-尼氏染色，一张用于金胺“O”荧光染色；挑取痰标本中呈脓样﹑干酪样可疑部分均匀涂抹成约2cm×1cm的卵圆形痰膜，尽量使2张痰片的取痰部位﹑痰膜厚度﹑痰膜大小基本一致；将涂好的痰片室温下干燥后于5s内穿过酒精灯火焰上方4次将其固定。

1.3.2染色方法

1.3.2.1传统萋-尼氏染色按《中国结核病防治规划﹑痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》规定方法进行初染﹑脱色﹑复染[4]。

1.3.2.2荧光染色初染：将已固定的玻片置于染色架上，滴加0.1%的金胺O染色液覆满玻片，放置15~20min；脱色：用自来水缓缓冲去初染液，滴加脱色液，脱色2min或至无色；复染：用自来水缓缓冲去脱色液，滴加0.5%高锰酸钾复染液覆满玻片1min，用自来水缓缓冲去复染液，将玻片沥干水分，晾干。

1.3.3显微镜镜检萋-尼氏染色涂片用生物显微镜，用100×油镜进行细致观察，在蓝色背景下抗酸杆菌呈红色杆状。荧光染色用LED荧光显微镜，40×物镜观察，在暗背景下抗酸杆菌发出黄绿色荧光，呈杆状略弯曲。

1.3.4结果报告萋-尼氏染色镜检结果按《中国结核病防治规划﹑痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》标准报告。荧光染色镜检结果报告标准：荧光抗酸杆菌阴性：0条/100视野；荧光抗酸杆菌阳性：1~9条/100视野；荧光抗酸杆菌阳性（1+）：10~49条/50视野；荧光抗酸杆菌阳性（2+）：1~9条/每视野；荧光抗酸杆菌阳性（3+）：10~99条/每视野；荧光抗酸杆菌阳性（4+）：>100条/每视野[4]。

2　结果

2013年10月至2015年3月本实验室共收集痰标本2106例，传统萋-尼氏染色法共检出阳性283例，阳性率13.4%，其中<1+有36例，1+有160例，2+有45例，3+有23例，4+有19例；荧光染色法共检出阳性315例，阳性率15.0%，其中<1+有55例，1+有173例，2+有45例，3+有23例，4+有19例。荧光染色法除与萋-尼氏法全部283例阳性结果完全相符外，另有32例标本萋-尼氏染色法检测为阴性，荧光染色法检测为阳性，此32例标本荧光染色法结果报告均为1+及<1+低含菌量标本。此32例含菌量低标本于检测当日用离心集菌法涂片，重新用萋-尼氏法染色镜检，均报告为阳性，两种方法检测结果阳性总数差异无统计学意义（χ2=2.00，P＞0.05），<1+两种方法检测结果差异有统计学意义（χ2=4.05，0.01

表1　荧光染色法与萋-尼氏染色法检测结果比较

3　讨论

从本资料中可见，痰标本直接涂片查找抗酸杆菌时，荧光染色法的敏感度高于传统萋-尼氏染色法。传统萋-尼氏染色法是基层结核病实验室发现涂阳肺结核病人的主要手段，该法只对少量的痰液进行检查，只有当细菌达到较高浓度（10000 个/ml）时才能观察到[5]，很大程度上限制了这种方法的检测灵敏度。而荧光染色法镜检是在暗背景下抗酸杆菌发出蓝绿色荧光，呈杆状略弯曲，痰细胞及杂质不发光，萋-尼氏染色法镜检时在蓝色痰细胞背景下找红色杆状菌，两种方法相比较荧光染色法肉眼更容易发现抗酸杆菌[6]。本次实验的2106例痰标本中32例低含菌量标本开始用萋-尼氏染色法检测时为阴性而用荧光染色法检测时为阳性，用离心集菌法重新对这32例痰标本涂片﹑染色﹑镜检，报告结果均为阳性。表明当痰标本含菌量较低时，荧光染色法镜检的敏感性优于传统萋-尼氏染色法，而特异性无差异[7]。

荧光染色LED显微镜检测法较传统萋-尼氏染色法操作简便。传统萋-尼氏染色法操作繁琐，技术要求较高，初染加热时易产生气溶胶，油镜观察视野范围小，对阴性结果的判读需选取300视野，镜检时间长，检验人员易疲劳，易漏检低含菌量涂片[8]。荧光染色LED显微镜检测法初染时不需加热，减少了生物安全隐患，镜检采用40×的高倍镜观察，观察视野范围大，对阴性结果的判读仅需选取100视野，显著加快了镜检速度，判读和报告结果变得简单﹑快捷[9]。

综上所述，金胺“O”荧光染色LED显微镜法检测痰中的抗酸杆菌具有操作简便﹑快捷﹑准确﹑可靠﹑灵敏度高，结果判读方便等优点[10]，与传统萋-尼氏染色法相比，能够显著提高低含菌量标本的检出率，可在结核病患者的早期诊断和治疗中推广应用。

参考文献

[1]国务院办公厅.全国结核病防治规划（2011-2015）[Z].国发办，2011：53.

[2]张立，周洪经，冯爽.荧光染色法在结核分枝杆菌检测中的应用[J].山东医药2014，54（7）：55-57.

[3]赵平，张淑芳，高文慧，等.北京市朝阳区肺结核患者细菌学检验结果分析[J].中国卫生检验杂志2008，18（9）：1821-1822.

[4]中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册[M].北京：中国医科大学出版社，2009：7-12.

[5]成诗明，马屿，周林，等.痰涂片阴性活动性肺结核的诊断与管理[M].北京：人民卫生出版社，2009：2-3.

[6]张小芬，曾希鹏，刘平.荧光染色LED显微镜查找痰中结核杆菌的应用[J].中国卫生检验杂志2010，20（12）：3286-3288.

[7]曾希鹏，张小芬，陈烨.2种染色方法查找痰中结核杆菌的比较[J].中国卫生检验杂志2014，24（23）：3402-3404.

[8]戴学海，金法祥，汤佳良，许鹏.金胺“O”荧光染色法在结核病细菌学检验中的应用[J].中国卫生检验杂志2008，18（5）：851，923.

[9]刘彬，陈小舟.荧光染色法检测痰中结核杆菌的应用[J].医学信息2013，26（3）：279.

[10]苏新娣.金胺“O”荧光染色法对结核病细菌学检验的价值[J].中国医药指南2013，11（26）：365-366.