间接免疫荧光法在台山地区艾滋病并发PCP的应用

陈达富，邵筱(、广东医学院附属台山医院，广东台山5900；、广东医学院，广东东莞5380)



间接免疫荧光法在台山地区艾滋病并发PCP的应用

陈达富1，邵筱2
(1、广东医学院附属台山医院，广东台山529200；2、广东医学院，广东东莞523820)

摘要：目的比较间接免疫荧光法（IFA）与瑞-姬氏复合染色法、荧光实时定量PCR法（Real-time PCR）三种方法对肺孢子菌肺炎的差异，探讨实验室方法IFA在诊断肺孢子菌肺炎的应用价值。方法通过回顾性分析，收集2013年1月至2015年8月间在我院经病原学及临床诊断确诊的肺孢子菌肺炎（PCP）患者56例作为实验组，另外收集60例非PCP感染的呼吸道疾病患者作为对照组，收集两组患者的痰液和支气管肺泡灌洗液(BALF)，分别用IFA、瑞-姬氏复合染色法、Real-time PCR对两组的痰液和BALF进行检测，比较三种方法的检测结果。结果通过比较，IFA检测与real-time PCR一致性极高，对痰液和BALF标本阳性检出率均高于瑞-姬氏复合染色法，P<0.05，差异显著。三种方法学对BALF的阳性检出率明显高于痰液，P<0.05。结论瑞-姬氏复合染色法由于方法学上的局限性，存在阳性率不高的问题。IFA无论对痰液或BALF的检测灵敏度均高于瑞-姬氏复合染色法，与Real-time PCR一致性极高。IFA可以作为常规方法用于基层医院PCP的检测。在本研究中，瑞-姬氏复合染色法、IFA、Real-time PCR对BALF标本的检测率高于痰液标本，临床上建议尽量留取BALF标本，条件无法许可的情况可留取痰液标本。

关键词：艾滋病；肺孢子菌；肺孢子菌肺炎；间接免疫荧光法；荧光实时定量PCR

卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii，PC)，简称肺孢子虫，根据分子生物学的研究，其实是一种特殊的真菌[1]，现在已经改称为肺孢子菌更为恰当，它是一种机会致病感染病原体，其引起的肺炎称为肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)。PC可在免疫功能低下的人群中诱发PCP，特别是AIDS患者容易发生PCP[2-4]。PCP是艾滋病患者最常见的感染和死亡原因之一[5]。目前国外已对AIDS患者等易感人群实施越来越多的PCP预防治疗，但在国内对PCP的早期诊断和治疗仍然有相当的难度[6]，由于误诊而延误治疗导致PCP患者病死率极高。现在PCP的确诊主要依据是靠在呼吸道分泌物里找到病原体PC[7]。台山地区一直是我国AIDS的高发区域，在台山地区建立高灵敏度、高特异性的诊断方法有重要意义。本研究对间接免疫荧光法（IFA）进行研究分析，探讨其在诊断PCP中的应用价值。

1　资料与方法

1.1一般资料通过回顾性分析，收集2013年1月至2015年8月间在台山市人民医院HIV阳性合并PCP患者56例作为实验组，另外收集60例非PCP感染的呼吸道疾病患者作为对照组，收集两组患者的痰液和支气管肺泡灌洗液(BALF)，分别用IFA与瑞-姬氏复合染色法、Real-time PCR对两组的痰液和BALF进行检测，比较三种方法的检测结果。

1.2标本采集

1.2.1痰液的留取能正常留取浓痰患者只需清洁口腔留取，无痰患者用3%的高渗盐水超声雾化吸入诱导排痰，在痰液中加人10%NaOH，于37℃水浴消化1h取出，经4500r/min离心5min留取沉淀物。

1.2.2支气管肺泡灌洗液（BALF）的留取通过3300型电子纤维支气管镜，向肺内灌入无菌生理盐水，反复多次回收灌洗液约10~30m l，经4000r/ min离心20min，取沉淀物检查。备注：留取BALF要注意患者是否能够耐受。

1.3仪器与试剂日本OLYMPUS公司CX40型普通光学显微镜；日本OLYMPUS公司IX81荧光显微镜；日本OLYMPUS公司3300型电子纤维支气管镜；广州达安公司DA7600PCR定量分析仪；珠海贝索生物技术有限公司瑞特染液和吉姆萨(Giesma)染色液；法国欧蒙公司间接免疫荧光肺孢子菌试剂盒；上海之江生物科技有限公司肺孢子菌荧光实时定量试剂盒。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件进行处理，计量资料符合正态分布的数据以平均数±标准差（±s）或百分比（%）表示。不符合正态分布的数据经自然对数转换正态化分析。计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

瑞-姬氏复合染色法、IFA、Real-time PCR对实验组和对照组痰液标本的检测结果见表1，对BALF的检测结果见表2。

表1　实验组和对照组三种方法对痰液的检测结果

从表1和表2中，IFA、Real-time PCR两种方法学对BALF的阳性检出率均高于痰液。IFA和Real-time PCR一致性高，对痰液和BALF的阳性检出率均高于瑞-姬氏复合染色法。

三种方法学对痰液、BALF的灵敏度和特异性比较见表3。

表3　三种方法学对痰液、BALF的灵敏度和特异性比较

从表3可见，IFA与瑞-姬氏复合染色法特异性均高于Real-time PCR，灵敏度IFA和Real-time PCR高于瑞-姬氏复合染色法。三种方法学BALF的检测灵敏度高于痰液的检测。

3　讨论

艾滋病(AIDS)是获得性免疫缺陷综合征的简称，选择性侵犯带有CD4分子的T淋巴细胞，导致CD4+T淋巴细胞进行性减少。致机体免疫力下降，常使HIV患者合并各种机会性感染[8]。台山地区为HIV的高发区域，台山市疾病控制中心也对此进行了相关文献[9，10]报道，而PCP是AIDS患者的常见的肺部感染[11]，死亡率高，所以在基层医院急需灵敏度更高的方法应用于临床实验室诊断。瑞-姬复合染色法是目前较为公认的确诊PCP的传统方法，但由于瑞-姬复合染色效果的差异及检验人员主观判断的差异，往往存在阳性率不高的问题。目前，研究较多的PCR方法学已经较多地应用到实验室中，但其灵敏度过高，容易引起假阳性，造成病人的过度治疗。

IFA因其特异性强、灵敏高、速度快等优点在国外已经普遍应用于实验室[12]，国外学者Hassan等认为IFA检测PC抗原的敏感性达100%[13]。但在国内的研究还较少。本研究中，间接免疫荧光法（IFA）对痰液标本和BALF标本检出灵敏度达到98.29%和94.64%，特异性均达到100%。通过对IFA、瑞-姬复合染色法与real-time PCR的比较，IFA与real-time PCR均有较高的灵敏度，而且比瑞-姬复合染色法有更好的灵敏度及更强的特异性。这是因为抗原抗体反应结合特异性比较高，而且人眼对荧光的辨认比较敏感，提高了标本的阳性检测率，同时减少了组（人员）间的主观差别。总之，本研究证实IFA操作简单，对痰液和BALF的检测均能满足临床需求，可以在基层医院进行推广应用。

通过本研究可知，纵观三种方法学对痰液和BALF的检测，均一致显示BALF检测阳性率高于痰液，痰液标本容易获取，而且对病人创伤性较少，但其有对PC的检出阳性率低的缺点，而且PCP患者往往存在痰液过少，难以留取的问题。有学者Gupta[14]就提出用BALF作为首选标本，学者Rodifio[15]也认为BALF的诊断率高，本研究基本与相关的研究相符，所以如果病人能够耐受，BALF是比较佳的选择。

参考文献

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·综述·

(收稿日期2015-10-26；修回日期2015-12-29)

通信作者：邵筱，男，1976年6月出生，博士，研究生导师，大学讲师，主要研究方向：病原生物学。

作者简介：陈达富，男，1981年7月出生，主管技师，本科，学士学位，主要研究方向：生物化学检验与微生物检验。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.010

中图分类号：R512.91，R446.62

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)01-0029-02