地中海贫血诊断方法研究进展

刘宜平，冯建军，尹维，舒向华，吕连华 ，王永碧

(1.绵阳市中心医院；2.绵阳市人民医院，四川 绵阳　621700)



地中海贫血诊断方法研究进展

刘宜平1，冯建军2，尹维2，舒向华2，吕连华2，王永碧2

(1.绵阳市中心医院；2.绵阳市人民医院，四川 绵阳621700)

目的：地中海贫血实验室诊断技术主要包括血液学筛查及基因检测两大类。前者主要以红细胞形态及其理化特性为诊断依据，包括红细胞形态分析、血常规分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白组分分析等；后者主要是以PCR为基础的各种基因检测技术来进行诊断，包括Southern印迹杂交、PCR反向点杂交法、实时荧光PCR的探针溶解曲线分析、基因芯片、DNA测序等。本文就近年来地中海贫血的部分诊断方法及其研究进展作一综述。

地中海贫血；诊断方法；筛查试验；基因检测

地中海贫血(thalassemia)，即珠蛋白生成障碍性贫血，是一组由珠蛋白基因缺失或点突变致使珠蛋白肽链合成部分或完全抑制的遗传性溶血性贫血疾病。临床表现根据病情严重程度不同而有所差异，患者主要以贫血、黄疸、肝脾肿大为突出表现。珠蛋白肽链分为α、β、γ、δ四种，而地中海贫血主要有α、β、δβ、δ四种类型，以前两种(α、β地中海贫血)最常见。

1　中海贫血发病率及分子基础

地中海贫血广泛分布于东南亚地区、地中海区域及少数非洲国家，我国南方如广东、广西、四川、云南、海南、福建、香港、台湾等地多见。每年全世界至少有33万新生儿患链状细胞贫血和地中海贫血，并且大约7%的孕妇携带地中海贫血基因[1]。李颖丰等[2]对我国23 809例育龄人群进行地中海贫血初筛,其阳性率为21.61%,初筛阳性者再行血红蛋白电泳发现可疑α地贫比率约14.80%、可疑β地贫6.82%，最后基因检测确诊α地贫基因携带率10.23%,β地贫基因携带率6.27%。国际上公认对高风险孕妇进行产前筛查能减少重型地中海贫血婴儿出生[3-4]。

α珠蛋白基因位于16P13.3，α地中海贫血可分为基因缺失型(多为缺失1个或2个α珠蛋白基因)和非基因缺失型(主要为α珠蛋白基因发生点突变或少数碱基缺失)。全世界已经发现40余种基因缺失可致α地中海贫血，其大多数为α0地中海贫血(即单倍体中2个α基因的mRNA都完全缺失，又名为α地中海贫血1)；少数为α+地中海贫血(即单倍体中1个α基因的mRNA部分缺失，又名α地中海贫血2)。我国已发现7种缺失型地中海贫血(即4种α0地中海贫血：-SEA、-THAI、-FL、-HW)和3种α+地中海贫血(-α3.7、-α4.2、-α2.7)。

其中我国以东南亚缺失型α地中海贫血—SEA、右侧缺失-α3.7、左侧缺失-α4.2最为常见。全世界共发现40余种非缺失型α地中海贫血，我国以HbCS和HbQS最常见。

β珠蛋白基因位于11P15.3,引起β地中海贫血的基因突变也可分为缺失型突变与非缺失型突变，大多数β地中海贫血属于非缺失型突变(点突变或者少数几个碱基缺失及插入)。全世界已发现200余种缺失型β地中海贫血，我国目前有30余种，其表型分为β0(即无β珠蛋白产生)和β+(有较低水平β珠蛋白产生)。轻型β地中海贫血为杂合子，重型β地中海贫血为β0或β+纯合子以及β0与β+的双重杂合子，中间型分子基因则较复杂多变。β地中海贫血的临床表现也因其基因组合的不同而各不相同。我国最常见β地中海贫血基因突变有：CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)、CD26(C>A)(HbE)、CD17(A>T)、CD71/72(+A),以上在我国南方地区人群基因频率超过90%[5-6]。

2　地中海贫血常用的诊断方法

地中海贫血实验室诊断技术主要包括血液学筛查及基因检测两大类。前者简便经济，故常用于大规模普查以及基层卫生机构的筛查；后者虽然操作复杂且费用较贵，但却能够更加精准地诊断地中海贫血。目前筛查试验包括红细胞形态分析、血细胞分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白组分分析等；而基因检测则主要包括Southern印迹杂交(Southern blot)、多重PCR、多重断裂点PCR、PCR反向点杂交法(PCR-RDB)、实时荧光PCR的探针溶解曲线分析(PMCA)、基因芯片、DNA测序、等位基因特异性扩增技术(ARMS)、变向梯度胶凝电泳(DGGE)、巢式PCR、PCR限制内切酶谱分析(PCR-RFLP)、单链构向多态性PCR(PCR-SSCP)。另外，产前诊断也是地中海贫血预防控制的一个重要环节。

2.1筛查试验

2.1.1红细胞形态分析地中海贫血患者血涂片检查示红细胞大小不均，常可见形态不规则的异形红细胞:如嗜碱性点彩红细胞、泪滴形红细胞、靶形红细胞等。其中靶形红细胞最多见，此种红细胞中央部位染色较深，周围区域苍白，而细胞边缘处又深染，形如射击之靶，当出现靶形红细胞时需高度警惕地中海贫血。

2.1.2血细胞分析红细胞基本参数是临床初步筛查地中海贫血最简单经济的常用指标[7]。红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)等参数都有助于地中海贫血的诊断。其红细胞呈典型小细胞、低色素性且大多红细胞内可见包涵体，国际地中海贫血协会推荐将MCV<78 fl、MCH<27 Pg作为筛查地中海贫血的截断值[8]。同时其余参数如RBC、Hb、HCT、MCHC、RDW也均有不同程度的改变，且网织红细胞比例常高于正常人。

2.1.3红细胞渗透脆性实验红细胞渗透脆性实验可检测在不同低渗透压盐水中红细胞的抵抗力。地中海贫血患者红细胞存在不同程度变形且体积变小，其表面积与体积的比值增大，故在低渗盐水中吸水膨胀的适应性较大(脆性降低)。但是红细胞渗透脆性实验并不能单独用于地中海贫血的诊断，必须将它和上述多种指标联合起来进行检测分析才能初步诊断地中海贫血。有学者将MCV、RDW以及红细胞渗透脆性实验联合起来用于地中海贫血的检测，可大大提高筛查的灵敏度和特异度，甚至能初步和缺铁性贫血进行鉴别[9]。

2.1.4血红蛋白组分析对血红蛋白进行分离鉴定和定量分析是诊断地中海贫血快速可靠的方法。血红蛋白组分分析能够定量检测HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBart，s等，常用的分析方法有：(1)普通血红蛋白电泳法：因PH8.5缓冲盐液中各种Hb等位点均<7，在电场作用下不同的血红蛋白以不同的速度向阳极移动，常用醋酸纤维素薄膜作为支撑物来定量分析血红蛋白[10]。(2)琼脂糖凝胶电泳：碱性环境下血红蛋白在电场中分离后染色,可对血红蛋白琼脂糖定量。(3)高效液相色谱：利用离子交换树脂作为固定相，高压下血红蛋白理化不同，故在分离柱停留时间不等，从而将血红蛋白分离出来。其中，高效液相色谱分析技术对β地中海贫血、Hb变异体、Hb A及Hb F筛查的敏感度及精确度尤其高[11-12]。

目前，国际地中海贫血协会推荐将HbA2的含量检测作为β-地中海贫血携带者诊断标准，因高效液相色谱可以同时对HbA2进行定量分析，故广泛应用于β-地中海贫血携带者的筛查。(4)毛细管电泳：血红蛋白经过毛细管分离通道，在电场中可以定向移动，不同血红蛋白移动速度不同，以此来分离各种血红蛋白并且可直接对血红蛋白进行定量分析，已逐渐在临床广泛应用。有报道称毛细管电泳综合了高效液相色谱和凝胶电泳的共同优点，具备高效、高灵敏度、可重复性等优点[13]。

普通血红蛋白电泳法及琼脂糖凝胶电泳因操作简单、成本低廉，故常用于基层医院地中海贫血的常规筛查；而毛细管电泳及高效液相色谱可以进一步完善前两者方法的不足，但因其成本高并且对质控要求也较高，故常用于大型实验室。

2.2基因检测

多年的研究证实，地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失或点突变引起的珠蛋白链合成障碍，故针对突变基因的检测能够更加准确地诊断该病。早在1976年，已提出利用DNA-DNA核糖杂交技术检测α珠蛋白的基因，标志着基因分子诊断的诞生。随着1985年具划时代意义的聚合酶链反应(PCR)技术的发明以及近几十年来PCR相关技术的不断完善，地中海贫血的基因诊断技术得到极大的发展并成为其诊断的金标准。

2.2.1Southern印迹杂交该方法的原理是提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，再转移到硝酸纤维膜上，最后与放射性核素标记的DNA或RNA探针杂交，用放射自显影检测酶解DNA片段的大小和位置。该方法操作所需样本量大且步骤繁琐，故其在临床中的应用受到限制。但需要提及的是Southern 印迹杂交是分析大片段缺失特别是α珠蛋白基因缺陷的金标准，常作为其他基因诊断及PCR产前诊断结果的确诊试验[14]。

2.2.2多重PCR及多重断裂点PCR(多重gap-PCR)PCR原理即利用DNA聚合酶对引物进行延伸，经变形、退火、延伸过程实现特定DNA片段的体外扩增。该方法操作简便，适合基层医院对地中海贫血的临床诊断。近年来，科学家们在PCR基础上发展出多重PCR，即在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段。这样可以根据每个突变点特异性扩增产物来判断结果，大大提高缺失型α地中海贫血筛查(如东南亚缺失-SEA、左缺失-α4.2、右缺失-α3.7)及静止性α地中海贫血诊断。

多重断裂点PCR(多重gap-PCR)的原理是在基因缺失区域内设计两到三对引物，根据PCR特异性扩增片段有无来判断基因型，同时还可根据阳性扩增片段及正常 对照片段来综合诊断被检者是地中海贫血纯合子还是杂合子或者是正常人。目前，该方法是国内外诊断α地中海贫血基因缺失最常用的方法，较多实验室用JfI跨越缺失基冈断裂点序列的Gap-PCR对缺失型α和β地中海贫血进行基因诊断[15]。

2.2.3PCR-反向点杂交法(PCR-RDB)原理是将一系列已知寡核苷酸探针固定于支持膜上，加入PCR产物进行液相探针杂交，可同时检测多种点突变。因该法快速、准确、所需样本量少，故已成为国内外实验室最常用的地中海贫血点突变检测方法，尤其适用于β地中海贫血点突变的检测[16]。但该法操作繁杂且易形成主观判断上的失误，故对实验室技术人员的技能要求较高，同时，如遇可疑结果须重复检测。

2.2.4实时荧光PCR的探针溶解曲线分析(PMCA)原理是运用实时荧光检测技术结合探针溶解曲线分析技术，在异常扩增后检测PCR产物多色荧光溶解曲线从而鉴定多种突变[17]。我国学者严提珍等[18]分别采用PMCA方法与PCR-RDB方法对451份外周血标本和84份胎儿绒毛、羊水、脐带血产前诊断标本进行检测，并用DNA测序法进行验证，结果发现前者比后者有更高的基因诊断符合率，能够更准确地检测出多种基因突变类型。但该方法还处于完善阶段，对技术要求高，操作复杂且费用昂贵，故仅在少数几个大型临床实验室中开展，暂时未能在临床工作中大规模应用。

2.2.5基因芯片原理是通过微加工及微电子技术，在固相介质(如玻片、塑料、硅片、聚丙烯酰胺凝胶等)上固定序列已知的核苷酸探针，与已被荧光素或同位素标记的核酸序列进行杂交,可通过激光共聚焦显微镜上反应点的荧光强弱及位置，获得一组序列完整互补的探针序列，重组出靶核酸的序列[19]。其优点是高效、灵敏、快速，可短时间同时检测多种基因突变，但是成本昂贵，目前尚未在临床诊断中大规模应用。

2.2.6DNA测序方法是将标本DNA经PCR扩增后，在DNA自动测序仪上进行序列分析。常用于当其他基因检测法与临床表型不符合时的进一步验证，或者是分析未知基因突变时选用的检测方法。该方法是判断基因点突变类型及位置的金标准，但是该法对实验设备及标本DNA浓度要求较高并且所需时间较长，目前多在实验室中应用。

2.2.7其他方法其他基因检测方法较多，如等位基因特异性扩增技术(ARMS)适合针对某种小片段突变类型的特定检测；变性梯度凝胶电泳(DGGE)费用低廉，适合大规模的未知突变基因筛查；巢式PCR(又名套内PCR)是胚胎植入前常用的基因诊断方法；PCR限制性内切酶谱分析(PCR-SSCP)常用来检测未知基因突变，但影响结果的因素较多，不能用于大片段基因(超过400碱基)的检测。

2.3胎儿产前诊断

目前胎儿产前诊断主要有胎儿基因诊断和超声检查。

2.3.1胎儿基因诊断胎儿基因诊断分为有创及无创性胎儿基因检查。何升等对1 072例高风险孕妇孕10～15周绒毛样本进行地贫基因检测，在产前诊断后1周内终止妊娠能有效避免重型地中海贫血患儿出生[20]。但通过穿刺手段采集绒毛、羊水等易对胎儿造成伤害，增加流产、宫内感染等风险。

1997年，Lo等[21]的研究发现妊娠母体血浆中存在胎儿的遗传物质，通过对胎儿遗传物质进行检测诊断能够避免有创检查带来的风险，更加安全。经过科学家们长时间的研究，无创性基因检测在2008年有了突破性进展，Galbiati等[22]利用PNA钳夹以微电子芯片技术检测孕妇血浆中游离的胎儿β珠蛋白基因突变，检测准确度为100%，特异性为98.3%。近年，对母体血浆中游离DNA的定量检测技术有了新的进展，利用母体血浆cff-DNA的二代测序技术，可对基因组范围的目标序列进行定量分析从而进行无创产前检测。我国开发了一种基于孕妇血浆DNA目标区域高深度测序，对可能携带致病性拷贝数变异(CNVs)的胎儿样本进行无创产前基因检测的方法，通过该方法，研究人员可以准确检测出胎儿是否患有地中海贫血[23]。相信在未来通过进一步的探索和完善，无创产前基因诊断能够更好地运用到临床工作中。

2.3.2产前超声检查产前超声检查具有安全、无创、简便、可重复等优点，报道显示其对地中海贫血组胎儿的正确诊断率可达92.3%。通过超声检测胎儿水肿成为重型地中海贫血产前筛查和诊断的常用方法，可作为基层医院地中海贫血产前诊断的选择[24]。

3　小结

在众多地中海贫血筛查及基因检测中，如何选择合适的检测方法需要血液学工作者们综合考虑地区人群特点、当地经济情况、技术水平等来最终决定。筛查方法须联合测定并综合分析；基因检测要按照国内外地中海贫血实验室操作指南[5,25]来操作，基因分型必须用两种不同原理的方法进行确诊。在我国α地中海贫血主要为缺失突变，β地中海贫血主要为点突变。故诊断前者优先选用缺失突变检测方法，如Gap-PCR、Southern blot等；后者优先选用点突变检测方法，如PCR-RDB、基因芯片、实时PCR基因分型等。对于“已知”突变诊断方法较多，如Gap-PCR、Southern blot、PCR-RDB等；对于“未知”突变，常用PCR-SSCP、变相高效液相色谱(DHPLC)等先将“未知”突变基因筛查出来，再用DNA测序分析这些“未知”基因。地中海贫血是发病率较高的遗传性疾病，除骨髓移植外，尚无较好的治疗方法。地中海贫血患者给社会及家庭带来巨大负担，故产前诊断对于预防地中海贫血患儿的出生非常重要，特别是在高发地区广泛开展地中海贫血患者及携带者筛查及诊断对提高该地区人口素质及降低地中海贫血发生率具有积极深远的意义。

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(学术编辑：魏锦)

Advances in diagnostic methods thalassemia

LIU Yi-ping1,FENG Jian-jun2,YIN Wei2,SHU Xiang-hua2,LV Lian-hua2，WANG Yong-bi2

(1.Mianyang Central Hospital;2.The People’s Hospital of Mianyang,Mianyang 621700,Sichuan,China)

【Abstract】Objective：Mediterranean Laboratory Diagnostic Techniques include screening test and genetic testing；the former diagnosis method is mainly based on the morphology of red blood cells and the physical and chemical properties,including forms of red blood cells,red blood cell permeability test,erythrocyte osmotic test,hemoglobin component analysis,high performance liquid chromatography (HPLC),etc.The latter is mainly based on various of molecular biology experiments developed on the basis of PCR,including Southern blot hybridization (Southern blot),PCR reverse dot blot hybridization (PCR-RDB),analysis of real-time fluorescent PCR probe dissolution curve (PMCA),gene chip and DNA sequencing,etc.In this paper some methods of diagnosis of the Mediterranean anemia are to be reviewed.

Thalassemia;Diagnostic methods;Screening test;Genetic testing

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.049综述

四川省卫生厅科技项目(120315)；四川省绵阳市科技局项目支持(12c006-10)

2015-12-12

刘宜平(1977-)，女 ，硕士，主治医生。

冯建军，E-mail：fjj0806@126.com

网络出版时间：2016-8-217∶48网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.098.html

1005-3697(2016)04-0622-04

R556

A