PDX-1基因克隆载体的体外构建

汪珊珊，陈明卫

(1安徽省第二人民医院，合肥230000；2安徽医科大学第一附属医院)



PDX-1基因克隆载体的体外构建

汪珊珊1，陈明卫2

(1安徽省第二人民医院，合肥230000；2安徽医科大学第一附属医院)

摘要：目的体外构建胰-十二指肠同源框-1(PDX-1)基因的克隆载体。方法采用TRIzol方法从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA，通过RT-PCR方法在体外扩增大鼠PDX-1 cDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定，割胶纯化后回收目的基因，与pMD-18T克隆载体连接构建，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定pMD-18T-PDX-1的正确构建。结果正确构建了含有PDX-1 cDNA的克隆载体pMD-18T-PDX-1，其中PDX-1 cDNA全长为908 bp。将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序，测定结果与GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致。结论成功构建了PDX-1基因克隆载体。该载体可为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供基础。

关键词：胰-十二指肠同源框-1；cDNA；胰岛细胞瘤；克隆载体

近年来，胰-十二指肠同源框-1(PDX-1)在胰腺的发育、分化、再生及胰岛素分泌过程中的作用受到广泛关注。PDX-1属于器官同源结构域蛋白，研究发现PDX-1基因与胰腺发育至关重要，不仅可促进胰腺早期发育和晚期胰岛β细胞的分化，还可促进胰岛素、葡萄糖转运蛋白2及胰岛淀粉样多肽的转录，甚至与胰岛的再生有关，可作为胰腺干细胞的特异性标志之一。此外，PDX-1还参与延缓β细胞的自身凋亡。因此，PDX-1基因在胰岛素正常分泌过程中不可缺少[1~5]。为进一步探讨PDX-1基因的功能及应用前景，本研究采用基因工程方法从体外提取大鼠胰岛细胞瘤的RNA，经RT-PCR技术，获得大鼠PDX-1基因的cDNA，进一步构建大鼠PDX-1基因的克隆载体pMD-18T-PDX-1。

1材料与方法

1.1材料pMD18-T载体(TaKaRa)；大鼠胰岛细胞瘤细胞株(中国科学院上海细胞生物学研究所)；大肠杆菌DH5α(华舜生物工程有限公司)；RT-PCR试剂盒(Fermentas)；PCR纯化和胶回收试剂盒(Tiangen)；质粒提取试剂盒(Fermentas)；TRIzol(Invitrogen)；氯仿、异丙醇、乙醇、胰蛋白胨、酵母提取物(上海生物工程公司)；琼脂糖、胰蛋白酶(Sigma)；限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ及DNA DL2000 marker(TaKaRa)。

1.2方法

1.2.1大鼠RNA的提取培养大鼠胰岛瘤细胞，待培养至贴壁80%~90%时，弃旧培养液，并用PBS洗涤细胞2次。经0.25%胰蛋白酶消化后，使细胞脱离瓶壁，呈悬浮状态。转移至15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入1 mL TRIzol，反复吹打；移至1.5 mL Eppendorf管内，室温静置5 min；向Eppendorf管内加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；吸取上清液，移入另一个高压灭菌的Eppendorf管内；向上清液内加入适当异丙醇(与上清液比例为1∶1)，上下混匀30 s，静置10 min；4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清液，加入1 mL 75%乙醇，混匀30 s；4 ℃ 7 500 r/min离心5 min；弃上清液，室温下干燥5~10 min；加入20 μL无RNA酶的水，并吹打混匀，55~60 ℃放置10 min，使RNA水解，后放置于-80 ℃保存。取5 μL大鼠RNA溶液溶于495 μL去离子水中，混匀，使用分光光度计测定A260、A280吸光度值，以计算RNA浓度。

1.2.2大鼠PDX-1基因的cDNA合成根据GenBank中大鼠PDX-1基因的mRNA序列(NM_022852.3)，选用Primer5.0软件在阅读框架两侧设计上下游引物：上游引物：5′-GGCTGCCACCATGAATAGTG-3′，下游引物：5′-ATGCCCATGTCCGCACTCTG-3′。以大鼠胰岛细胞瘤mRNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增长度为908 bp。PCR反应体系为20 μL，包含DEPC-H2O 8 μL，Oligo(dT)181 μL，RNA溶液3 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockTM RNase Inhibitor(20 U/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，Revert AidTM M-MuLV Reverse Transcriptuse(200 U/μL) 1 μL。PCR反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。PCR反应体系为50 μL，包含大鼠胰岛细胞瘤cDNA第一链4 μL，10×PCR buffer(含MgCl2) 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，上游引物(10 μmol/μL)2 μL，下游引物(10 μmol/μL)2 μL，DEPC-H2O 32 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循环30次，终末延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取PCR产物10 μL，以DL 2000 Marker为对照，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带出现。

1.2.3pMD-18T-PDX-1克隆载体的构建在紫外观察灯下，用灭菌的锋利刀片切取目的片段，按照胶回收与纯化试剂盒说明书，回收胶中目的片段，并进行纯化。将得到的PDX-1 cDNA纯化物与pMD-18T克隆载体进行连接，连接体系包含：pMD18-T Vector 1 μL，PDX-1 cDNA 2 μL，dH2O 2 μL，5 μL SolutionⅠ。连接条件为16 ℃反应30 min。将pMD-18T-PDX-1连接产物转化至制备好的感受态大肠杆菌DH5α，将转化后的DH5α均匀涂于20 mL含氨苄青霉素的LB固体培养基琼脂平板，37 ℃倒置培养过夜，以筛选阳性克隆。对筛选的阳性克隆按照质粒提取试剂盒说明书进行抽提纯化。

1.2.4pMD-18T-PDX-1克隆载体的鉴定选取目的基因(PDX-1基因)片段中不存在，但在克隆载体(pMD-18T)插入目的基因片段前、后存在的酶切位点，如BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切克隆载体，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。同时将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆送交上海生物工程有限公司进行DNA序列测定，并将测序结果与GenBank中的PDX-1 cDNA序列进行对比。

2结果

2.1RNA的定量取5 μL大鼠RNA溶液溶于495 μL去离子水中，混匀，使用分光光度计测定A260、A280吸光度值，以计算RNA浓度。A260=0.642，A280=0.308，A260/A280=2.084，表明RNA纯度较高。RNA浓度(μg/μL)=(A260×40×稀释倍数)/1 000=A260×4=2.568 μg/μL。

2.2PDX-1基因RT-PCR扩增以大鼠胰岛细胞瘤RNA为模板，进行RT-PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳可见一条约900 bp大小的特异性条带，与预期的目的基因片段(908 bp)大小一致，说明该条带为预期的目的基因片段。见图1。

注：1为PDX-1基因；2为marker。

2.3PDX-1基因克隆载体的双酶切鉴定将重组克隆载体pMD-18T-PDX-1，分别经BamH Ⅰ单酶切、Hind Ⅲ单酶切，及同时经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳可见单酶切产生1个条带，代表已经切开的线性化重组克隆载体pMD-18T-PDX-1，而双酶切产生2个条带，其中较小片段位于1 000 bp左右处，代表插入的PDX-1基因片段，较大片段位于2 500 bp左右处，为线性化的pMD-18T载体。见图2。

2.4PDX-1基因克隆载体的序列分析将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序，测定结果与GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致，表明大鼠PDX-1基因已成功克隆到pMD-18T克隆载体中。见插页Ⅱ图8。

注：M为marker；1为未经酶切的重组克隆载体pMD-18T-PDX-1；2为重组克隆载体pMD-18T-PDX-1经BamH Ⅰ单酶切后的产物；3为重组克隆载体pMD-18T-PDX-1经Hind Ⅲ单酶切后的产物；4为重组克隆载体pMD-18T-PDX-1经BamH Ⅰ及Hind Ⅲ双酶切后的产物。

图2重组克隆载体pMD-18T-PDX-1的酶切鉴定分析

3讨论

PDX-1基因除可诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞之外，还可诱导肝细胞、肝内导管上皮细胞、成肌细胞等其他细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化[6~12]。因此，在糖尿病细胞治疗领域，以PDX-1为基础的基因工程技术可弥补胰腺移植的供体不足问题。

基于PDX-1基因在胰腺发育及β细胞分化表达中的重要作用，本研究从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA，以mRNA为模板，经RT-PCR技术克隆大鼠PDX-1基因的cDNA，并在体外构建PDX-1基因克隆载体pMD-18T-PDX-1，经双酶切电泳及DNA测序分析，证明PDX-1基因已成功克隆到pMD-18T克隆载体中。

本研究所使用的大鼠胰岛细胞瘤细胞株在体外培养具有高生长率、稳定性较好的特点。因胰腺含有大量内源性的RNA酶，从胰腺提取RNA易导致降解而失败，而从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA，减少了内源性RNA酶对RNA的降解作用。在本研究中，选取TRIzol试剂提取细胞中的RNA。TRIzol试剂可直接从细胞或组织中提取总RNA，且具有操作简单、耗时短的特点，在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，加入氯仿后离心，样品可分成水样层和有机层，RNA存在于其中的水样层中。通过收集水样层后，加入异丙醇沉淀来还原RNA，再通过加入乙醇沉淀能析出其中的DNA，避免对RNA提取的污染。故本实验选

取从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中用TRIzol试剂提取RNA，所提取的RNA经分光光度计测定A260/A280大于2，表明RNA纯度较高。本研究在体外成功构建了PDX-1基因的克隆载体。该载体为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供了基础。

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(收稿日期：2015-09-24)

中图分类号：R587

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)04-0031-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.010

基金项目：安徽省教育厅自然科学基金资助项目(KJ2012Z192)。