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PDX-1基因克隆载体的体外构建

2016-03-23汪珊珊陈明卫

山东医药 2016年4期
关键词:双酶琼脂糖细胞株

汪珊珊,陈明卫

(1安徽省第二人民医院,合肥230000;2安徽医科大学第一附属医院)



PDX-1基因克隆载体的体外构建

汪珊珊1,陈明卫2

(1安徽省第二人民医院,合肥230000;2安徽医科大学第一附属医院)

摘要:目的体外构建胰-十二指肠同源框-1(PDX-1)基因的克隆载体。方法采用TRIzol方法从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA,通过RT-PCR方法在体外扩增大鼠PDX-1 cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶纯化后回收目的基因,与pMD-18T克隆载体连接构建,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定pMD-18T-PDX-1的正确构建。结果正确构建了含有PDX-1 cDNA的克隆载体pMD-18T-PDX-1,其中PDX-1 cDNA全长为908 bp。将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序,测定结果与GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致。结论成功构建了PDX-1基因克隆载体。该载体可为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供基础。

关键词:胰-十二指肠同源框-1;cDNA;胰岛细胞瘤;克隆载体

近年来,胰-十二指肠同源框-1(PDX-1)在胰腺的发育、分化、再生及胰岛素分泌过程中的作用受到广泛关注。PDX-1属于器官同源结构域蛋白,研究发现PDX-1基因与胰腺发育至关重要,不仅可促进胰腺早期发育和晚期胰岛β细胞的分化,还可促进胰岛素、葡萄糖转运蛋白2及胰岛淀粉样多肽的转录,甚至与胰岛的再生有关,可作为胰腺干细胞的特异性标志之一。此外,PDX-1还参与延缓β细胞的自身凋亡。因此,PDX-1基因在胰岛素正常分泌过程中不可缺少[1~5]。为进一步探讨PDX-1基因的功能及应用前景,本研究采用基因工程方法从体外提取大鼠胰岛细胞瘤的RNA,经RT-PCR技术,获得大鼠PDX-1基因的cDNA,进一步构建大鼠PDX-1基因的克隆载体pMD-18T-PDX-1。

1材料与方法

1.1材料pMD18-T载体(TaKaRa);大鼠胰岛细胞瘤细胞株(中国科学院上海细胞生物学研究所);大肠杆菌DH5α(华舜生物工程有限公司);RT-PCR试剂盒(Fermentas);PCR纯化和胶回收试剂盒(Tiangen);质粒提取试剂盒(Fermentas);TRIzol(Invitrogen);氯仿、异丙醇、乙醇、胰蛋白胨、酵母提取物(上海生物工程公司);琼脂糖、胰蛋白酶(Sigma);限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ及DNA DL2000 marker(TaKaRa)。

1.2方法

1.2.1大鼠RNA的提取培养大鼠胰岛瘤细胞,待培养至贴壁80%~90%时,弃旧培养液,并用PBS洗涤细胞2次。经0.25%胰蛋白酶消化后,使细胞脱离瓶壁,呈悬浮状态。转移至15 mL离心管,1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入1 mL TRIzol,反复吹打;移至1.5 mL Eppendorf管内,室温静置5 min;向Eppendorf管内加入200 μL氯仿,剧烈振荡15 s,室温静置5 min;4 ℃ 12 000 r/min离心15 min;吸取上清液,移入另一个高压灭菌的Eppendorf管内;向上清液内加入适当异丙醇(与上清液比例为1∶1),上下混匀30 s,静置10 min;4 ℃ 12 000 r/min离心10 min;弃上清液,加入1 mL 75%乙醇,混匀30 s;4 ℃ 7 500 r/min离心5 min;弃上清液,室温下干燥5~10 min;加入20 μL无RNA酶的水,并吹打混匀,55~60 ℃放置10 min,使RNA水解,后放置于-80 ℃保存。取5 μL大鼠RNA溶液溶于495 μL去离子水中,混匀,使用分光光度计测定A260、A280吸光度值,以计算RNA浓度。

1.2.2大鼠PDX-1基因的cDNA合成根据GenBank中大鼠PDX-1基因的mRNA序列(NM_022852.3),选用Primer5.0软件在阅读框架两侧设计上下游引物:上游引物:5′-GGCTGCCACCATGAATAGTG-3′,下游引物:5′-ATGCCCATGTCCGCACTCTG-3′。以大鼠胰岛细胞瘤mRNA为模板进行RT-PCR扩增,扩增长度为908 bp。PCR反应体系为20 μL,包含DEPC-H2O 8 μL,Oligo(dT)181 μL,RNA溶液3 μL,5×Reaction Buffer 4 μL,RiboLockTM RNase Inhibitor(20 U/μL) 1 μL,10 mmol/L dNTP Mix 2 μL,Revert AidTM M-MuLV Reverse Transcriptuse(200 U/μL) 1 μL。PCR反应条件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,4 ℃ 10 min。PCR反应体系为50 μL,包含大鼠胰岛细胞瘤cDNA第一链4 μL,10×PCR buffer(含MgCl2) 5 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,Taq DNA聚合酶1 μL,上游引物(10 μmol/μL)2 μL,下游引物(10 μmol/μL)2 μL,DEPC-H2O 32 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,62 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,循环30次,终末延伸72 ℃ 10 min,4 ℃保存。取PCR产物10 μL,以DL 2000 Marker为对照,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带出现。

1.2.3pMD-18T-PDX-1克隆载体的构建在紫外观察灯下,用灭菌的锋利刀片切取目的片段,按照胶回收与纯化试剂盒说明书,回收胶中目的片段,并进行纯化。将得到的PDX-1 cDNA纯化物与pMD-18T克隆载体进行连接,连接体系包含:pMD18-T Vector 1 μL,PDX-1 cDNA 2 μL,dH2O 2 μL,5 μL SolutionⅠ。连接条件为16 ℃反应30 min。将pMD-18T-PDX-1连接产物转化至制备好的感受态大肠杆菌DH5α,将转化后的DH5α均匀涂于20 mL含氨苄青霉素的LB固体培养基琼脂平板,37 ℃倒置培养过夜,以筛选阳性克隆。对筛选的阳性克隆按照质粒提取试剂盒说明书进行抽提纯化。

1.2.4pMD-18T-PDX-1克隆载体的鉴定选取目的基因(PDX-1基因)片段中不存在,但在克隆载体(pMD-18T)插入目的基因片段前、后存在的酶切位点,如BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切克隆载体,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。同时将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆送交上海生物工程有限公司进行DNA序列测定,并将测序结果与GenBank中的PDX-1 cDNA序列进行对比。

2结果

2.1RNA的定量取5 μL大鼠RNA溶液溶于495 μL去离子水中,混匀,使用分光光度计测定A260、A280吸光度值,以计算RNA浓度。A260=0.642,A280=0.308,A260/A280=2.084,表明RNA纯度较高。RNA浓度(μg/μL)=(A260×40×稀释倍数)/1 000=A260×4=2.568 μg/μL。

2.2PDX-1基因RT-PCR扩增以大鼠胰岛细胞瘤RNA为模板,进行RT-PCR扩增,经1.0%琼脂糖凝胶电泳可见一条约900 bp大小的特异性条带,与预期的目的基因片段(908 bp)大小一致,说明该条带为预期的目的基因片段。见图1。

注:1为PDX-1基因;2为marker。

2.3PDX-1基因克隆载体的双酶切鉴定将重组克隆载体pMD-18T-PDX-1,分别经BamH Ⅰ单酶切、Hind Ⅲ单酶切,及同时经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过琼脂糖凝胶电泳可见单酶切产生1个条带,代表已经切开的线性化重组克隆载体pMD-18T-PDX-1,而双酶切产生2个条带,其中较小片段位于1 000 bp左右处,代表插入的PDX-1基因片段,较大片段位于2 500 bp左右处,为线性化的pMD-18T载体。见图2。

2.4PDX-1基因克隆载体的序列分析将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序,测定结果与GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致,表明大鼠PDX-1基因已成功克隆到pMD-18T克隆载体中。见插页Ⅱ图8。

注:M为marker;1为未经酶切的重组克隆载体pMD-18T-PDX-1;2为重组克隆载体pMD-18T-PDX-1经BamH Ⅰ单酶切后的产物;3为重组克隆载体pMD-18T-PDX-1经Hind Ⅲ单酶切后的产物;4为重组克隆载体pMD-18T-PDX-1经BamH Ⅰ及Hind Ⅲ双酶切后的产物。

图2重组克隆载体pMD-18T-PDX-1的酶切鉴定分析

3讨论

PDX-1基因除可诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞之外,还可诱导肝细胞、肝内导管上皮细胞、成肌细胞等其他细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化[6~12]。因此,在糖尿病细胞治疗领域,以PDX-1为基础的基因工程技术可弥补胰腺移植的供体不足问题。

基于PDX-1基因在胰腺发育及β细胞分化表达中的重要作用,本研究从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA,以mRNA为模板,经RT-PCR技术克隆大鼠PDX-1基因的cDNA,并在体外构建PDX-1基因克隆载体pMD-18T-PDX-1,经双酶切电泳及DNA测序分析,证明PDX-1基因已成功克隆到pMD-18T克隆载体中。

本研究所使用的大鼠胰岛细胞瘤细胞株在体外培养具有高生长率、稳定性较好的特点。因胰腺含有大量内源性的RNA酶,从胰腺提取RNA易导致降解而失败,而从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA,减少了内源性RNA酶对RNA的降解作用。在本研究中,选取TRIzol试剂提取细胞中的RNA。TRIzol试剂可直接从细胞或组织中提取总RNA,且具有操作简单、耗时短的特点,在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,加入氯仿后离心,样品可分成水样层和有机层,RNA存在于其中的水样层中。通过收集水样层后,加入异丙醇沉淀来还原RNA,再通过加入乙醇沉淀能析出其中的DNA,避免对RNA提取的污染。故本实验选

取从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中用TRIzol试剂提取RNA,所提取的RNA经分光光度计测定A260/A280大于2,表明RNA纯度较高。本研究在体外成功构建了PDX-1基因的克隆载体。该载体为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供了基础。

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(收稿日期:2015-09-24)

中图分类号:R587

文献标志码:A

文章编号:1002-266X(2016)04-0031-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.010

基金项目:安徽省教育厅自然科学基金资助项目(KJ2012Z192)。

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