甲状腺乳头状癌组织中BRAF基因突变及CyclinD1蛋白表达的临床意义

卢军峰，解乃昌，马艳红，段友良，徐良

(1山东省交通医院，济南250031；2广西医科大学第一附属医院)



·临床研究·

甲状腺乳头状癌组织中BRAF基因突变及CyclinD1蛋白表达的临床意义

卢军峰1，解乃昌2，马艳红1，段友良1，徐良1

(1山东省交通医院，济南250031；2广西医科大学第一附属医院)

摘要：目的观察甲状腺乳头状癌(PTC)组织中BRAF基因突变及细胞周期调控基因蛋白(CyclinD1)表达情况，探讨其临床意义。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测115例PTC组织中BRAF基因，通过DNA序列分析计算基因突变率；采用免疫组织化学技术检测CyclinD1蛋白。结果本组BRAF基因突变率为48.7%(56/115)，CyclinD1蛋白阳性表达率为65.2%(75/115)；颈淋巴结转移阳性与阴性者BRAF基因突变率分别为73.5%(25/34)、38.3%(31/81)，P=0.001； CyclinD1蛋白阳性表达率分别为70.6%(24/34)、63.0%(51/81)，P=0.522；BRAF基因突变者CyclinD1蛋白阳性表达率为80.4%(45/56)，BRAF基因野生型者CyclinD1蛋白阳性表达率为50%(30/59)，二者比较P=0.002。结论BRAF基因突变及CyclinD1蛋白阳性表达对PTC的发生、发展起促进作用，二者对评估PTC患者的预后及术后复发的综合治疗效果有一定临床价值。

关键词：甲状腺癌；BRAF基因；细胞周期蛋白D1；免疫组织化学技术

近几年众多学者在甲状腺乳头状癌(PTC)分子生物学研究中检测到高频率的BRAF基因突变。研究发现，BRAF基因第15位外显子上T1799A(曾被认为是T1796A)位突变可导致BRAF中的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)替代(V600E)，使一系列蛋白激酶异常激活，进而促进细胞异常增殖并导致肿瘤形成[1]。有研究认为，肿瘤的发生、发展是一种细胞周期疾病，细胞因子调控异常，导致细胞进入病理状态异常增殖而发生肿瘤；G1期调节中，细胞周期调控正性因子CyclinD1的过度表达引起细胞的失控性生长，从而导致肿瘤的发生[2,3]。本研究分析PTC组织中BRAF基因突变及CyclinD1蛋白表达情况，探讨其在PTC临床诊断及治疗中的价值。

1资料与方法

1.1临床资料收集2002年9月~2013年3月山东省交通医院及广西医科大学第一附属医院病理科存档的PTC蜡块标本115份，术后和实验前均经两位病理科主任医师再次确诊。患者男24例、女91例，年龄17~76岁、平均45岁；均为首次手术且术前未行放射碘治疗。手术方式：患侧全切+峡部切除(癌灶<1.0 cm，包膜内，无淋巴结转移且位于上极)32例，患侧全切+峡部切除+对侧大部分切除(癌灶>1.0 cm，包膜内且位于下极)49例，甲状腺次全切除术(浸出包膜、远处转移或多个癌灶)13例，甲状腺全切除术及颈部淋巴结清扫(双侧癌灶或有淋巴结转移)21例。TNM分期：T1~3N0M0期81例，T1~3N1M0期34例。

1.2观察方法

1.2.1BRAF基因突变检测采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术。PTC组织中BRAF基因的提取、扩增、琼脂糖凝胶电泳、PCR-SSCP检测、序列分析由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。对有异常泳动条带标本的PCR扩增产物行DNA测序，BRAF基因第15外显子发生T-1799-A替换，突变测序图出现双峰为发生BRAF基因突变。

1.2.2CyclinD1蛋白表达测定采用免疫组化SP法。CyclinD1蛋白阳性表达定位于细胞核，胞质多伴有微弱染色，仅胞质染色则视为阴性；在同一光强亮度下，阳性判断标准参照Takahashi等的方法，同一高倍镜下(×400倍)每张切片随机选取10个视野进行拍照计数。阳性细胞染色程度淡黄色为1分，橙黄色为2分，棕褐色为3分；阳性着色细胞百分比≤5%为0分，5%<~25%为1分，25%<~50%为2分，>50%为3分；两项染色结果评分的乘积分值<2分为阴性，≥2分为阳性。

1.2.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计数资料以率表示，比较用四格表χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1BRAF基因突变情况本组56例标本出现异常的SSCP泳动条带，BRAF基因突变率为48.7%(56/115)，见图1。DNA测序显示，第15外显子发生T-1799-A替换，突变测序图出现了双峰，见插页Ⅲ图9；BRAF基因野生型测序图未见双峰，见插页Ⅲ图10。

注：1、3、5为对照组织；2、4、6为PTC组织。

2.2CyclinD1蛋白表达情况本组CyclinD1蛋白阳性表达率为65.2%(75/115)。见插页Ⅲ图11。

2.3颈淋巴结转移者BRAF突变及CyclinD1蛋白表达情况本组颈淋巴结转移阳性及阴性患者BRAF基因突变率分别为73.5%(25/34)、38.3%(31/81)；P=0.001；CyclinD1蛋白阳性表达率分别为70.6%(24/34)、63.0%(51/81)，P=0.522。

2.4PTC组织中BRAF突变与CyclinD1蛋白表达的相关性56例BRAF基因突变者CyclinD1蛋白阳性表达率为80%(45/56)，BRAF基因野生型CyclinD1蛋白表达阳性率为50%(30/59)；二者比较，P=0.002。

3讨论

BRAF基因又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF基因的家族成员，位于人染色体7q34，含18个外显子，编码蛋白质分子全长约94 kD，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶类，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化剂，在细胞凋亡和增殖过程中起重要作用，其位于MAPK通路入口处，将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，调节细胞的生长、发育。BRAF突变最初是在Davies等[4]的恶性黑色素瘤的研究中被发现。国外大量研究表明，BRAF突变同样发生于甲状腺癌，且发生率仅次于黑色素瘤，提示BRAF基因突变型PTC的组织侵袭性更高，容易浸润甲状腺周围组织，临床分期更晚[5，6]。

CyclinD1是G1期周期素，在G1期调节中其为重要的G1/S期转换正向调控因子，使细胞从G1期向S期转化。CyclinD1的过度表达将导致G1期缩短并提前进入S期，使细胞增殖失控，最终导致肿瘤发生。近年来研究发现，CyclinD1在肿瘤中的过表达与细胞侵袭能力有关，在甲状腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌等肿瘤组织中CyclinD1过表达与淋巴结转移有关，CyclinD1过表达的肿瘤组织更具有侵袭力和更高的淋巴结转移率[7，8]。

本研究中纳入的115例PTC标本皆为分化型甲状腺乳头状癌，BRAF基因突变检出率(48.7%)与汪杰等[9]报道的(29%~83%)一致。研究发现，PTC原发灶和转移淋巴结中常检测到BRAF基因突变，Meta分析研究结果显示，BRAF基因突变型PTC的组织侵袭力高，容易浸润甲状腺周围组织，临床病理分期高；包膜受侵犯或者发生淋巴结转移的PTC与无转移灶的PTC相比，BRAF基因突变率更高[10]。本研究CyclinD1阳性表达率为65.2%，PTC颈淋巴结转移与否与CyclinD1表达无明显关系。BRAF基因突变者PTC组织中CyclinD1呈过高表达，CyclinD1表达上调与BRAF基因突变呈正相关，二者对PTC临床病理预后风险评估体系的参数(如AGES、AMES、MACIS、UICC-TNM分期)将起到很好的补充作用，可作为PTC临床病理诊断的重要辅助指标，亦可作为评估PTC侵袭能力、临床手术方式的选择、术后辅助放疗指导等的重要参数。

综上所述，PTC的演变与BRAF基因突变关系密切，BRAF基因突变可作为PTC颈淋巴结转移危险因素的评估指标，其突变多提示PTC预后不良。CyclinD1高表达是PTC一个较早的分子事件，其与BRAF基因突变具有协同作用，可促进PTC的发生、发展；对评估PTC患者的预后具有一定的参考价值。

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(收稿日期：2015-05-06)

中图分类号：R736.1

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)04-0036-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.012

基金项目：广西自然科学基金资助项目(桂科自0728132)。