人软骨糖蛋白39对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞增殖的影响及意义

安燕，庞春艳，闫慧明

(1包头医学院第二附属医院，内蒙古包头014030；2包头医学院第一附属医院)



人软骨糖蛋白39对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞增殖的影响及意义

安燕1，庞春艳2，闫慧明1

(1包头医学院第二附属医院，内蒙古包头014030；2包头医学院第一附属医院)

摘要：目的观察人软骨糖蛋白39(HCgp-39)对类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响，并探讨其意义。方法针对HCgp-39 cDNA的第183～203 bp和第361～381 bp分别设计并合成载体siRNA1和siRNA2。选取初诊RA患者40例，取全血3 mL，分离并培养PBMC。将培养的PBMC随机分为四组， HCgp-39-siRNA1组加入载体siRNA1，HCgp-39-siRNA2组加入载体siRNA2，对照组不加入载体，空载体组加入质粒载体pSUPER.basi;培养24 h，采用RT-PCR法检测各组HCgp-39 mRNA表达，采用MTT法检测细胞增殖抑制率。结果对照组、空载体组、HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组HCgp-39 mRNA灰度值分别为61.197±5.542、55.718±5.120、39.912±4.218、36.748±2.877，HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组低于对照组、空载体组(P均<0.05)；细胞增殖抑制率分别为0、9.27%、43.97%、43.74%，HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组高于对照组、空载体组(P均<0.05)。结论HCgp-39可促进RA患者PBMC增殖，通过RNAi技术特异性阻断Hcgp-39表达可能为RA的治疗提供新的手段。

关键词：类风湿关节炎；软骨糖蛋白-39；RNA干扰；外周血单个核细胞

类风湿关节炎(RA)是一种病因尚未明确的慢性全身性疾病，以慢性、对称性、多关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现。类风湿因子(RF)阳性是RA的诊断标准之一，但其在RA早期诊断及诊断准确性上存在较大的局限性[1]。人软骨糖蛋白39(HCgp-39)是RA的一种新抗原[2,3]，其衍生肽与HLA-DR1、HLA-DR4基因具有很高的亲和力，并能被RA外周血T淋巴细胞高度特异识别。研究证实，HLA-DR1和HLA-DR4基因通过抗原特异性免疫应答反应参与RA发病[4]。RA患者关节软骨细胞、滑膜细胞和外周血单个核细胞(PBMC)均高度表达HCgp-39 mRNA[5]，而正常人几乎没有表达，且HCgp-39水平与RA活动性相关[4]，可能成为一种新的判断RA病情的指标[6]。本研究通过RNA干扰(RNAi)技术[7]观察HCGP-39对RA患者PBMC增殖的影响，并探讨其意义。

1资料与方法

1.1临床资料选择2012年10月～2014年12月

在包头医学院第二附属医院风湿免疫科初诊的RA患者40例，均符合1987年美国风湿病协会RA诊断标准；未接受任何抗RA治疗。其中女29例、男11 例，年龄(41±10)岁，均无严重感染、肝病、肿瘤、肾病、糖尿病及其他风湿性疾病等。

1.2载体的构建针对HCgp-39 cDNA的第183～203 bp和第361～381 bp设计合成两条双链DNA，分别命名为dsDNA1、dsDNA2。双酶切后的pSUPER.basic与dsDNA连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，并进行阳性克隆[8]。构建后的载体经酶切、重组体测序鉴定，分别命名为siRNA1和siRNA2。上述操作均由包头医学院第一附属医院中心实验室完成。

1.3PBMC分离及处理清晨空腹抽取患者肘正中静脉血3 mL于肝素锂抗凝管中，取肝素抗凝新鲜全血3 mL，加等体积生理盐水稀释，取3 mL淋巴细胞分离液加入离心管，将稀释后血液沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，1 900 r/min离心10 min，液体共分三层，上层为血浆，中层为淋巴细胞分离液，下层为血细胞，上层和中层之间云雾状的为单个核细胞层。将吸管直接插入单个核细胞层并吸取该层细胞，放入另一离心管中，加入10 mL生理盐水稀释分离的淋巴细胞，1 700 r/min离心10 min，弃上清。重复洗涤1次，1 500 r/min离心10 min，弃上清。吹打重悬细胞，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待分离培养的PBMC细胞长满培养瓶底面积50%～60%时制成单细胞悬液，接种于96孔培养板，密度为1×105个/mL，每孔200 μL。随机分为四组， HCgp-39-siRNA1组加入载体siRNA1，HCgp-39-siRNA2组加入载体siRNA2，对照组不加入载体，空载体组加入质粒载体pSUPER.basi。各组培养4 h，每孔加入含FBS的RPMI 1640培养液，继续培养。

1.4HCgp-39 mRNA表达检测各组培养24 h后收集细胞，提取RNA。将所需离心管、PCR反应管和微量吸头在0.1% DEPC溶液中浸泡24 h，烘干后高压灭菌备用。RNA提取步骤参照试剂盒说明书。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。HCgp-39上游引物：5′-TAAGGATCCATGAACACCCAGATG-3′，下游引物：5′-GTGAAGCTTCTAAGGACTTGCATC -3′，扩增产物为360 bp。以GAPDH作为内参照，GAPDH上游引物：5′-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′，扩增产物230 bp。取5 μL扩增产物，在120 V、90 mA条件下进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统照相并用软件进行灰度值分析。

1.5细胞增殖抑制率检测各组培养24 h时采用倒置显微镜观察细胞增殖情况，并分别加入MTT 20 μL/孔(5 mg/mL)，继续培养4 h，吸出培养液后，加入二甲基亚砜150 μL/孔，室温下将平板在微孔板上震荡10 min，使结晶物完全溶解，用酶标仪在492 nm波长处测定各孔光密度值(OD值；用空白孔调零)。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。

2结果

2.1各组HCgp-39 mRNA表达比较对照组、空载体组、HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组灰度值分别为61.197±5.542、55.718±5.120、39.912±4.218、36.748±2.877，HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组低于对照组、空载体组(P均<0.05)。

2.2各组细胞增殖情况比较培养24 h时倒置显微镜下观察发现，与对照组和空载体组相比，HCgp-39-siRNA1组与HCgp-39-siRNA2组细胞形态不规则，漂浮细胞增多，出现大量凋亡细胞团。对照组、空载体组、HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组细胞增殖抑制率分别为0、9.27%、43.97%、43.74%，HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组高于对照组、空载体组(P均<0.05)。HCgp-39-siRNA1组与HCgp-39-siRNA2组比较无统计学差异(P>0.05)。

注：M为100 bp DNA marker；1为RA对照组；2为空载体组；3为HCgp-39-siRNA1组；4为HCgp-39-siRNA2组。

图1各组HCgp-39 mRNA表达

3讨论

HCgp-39是一种含383个氨基酸的蛋白质，来源于关节软骨细胞、滑膜细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞，与细菌壳质酶蛋白质家族有结构上的同源性，但并不具备壳质酶活性。目前HCgp-39的确切生理作用尚不明确，但已有研究表明其可能与组织重建有关，并能反映关节软骨降解破坏和滑膜炎症程度[4]。近年来已有研究提示，HCgp-39是RA自身免疫过程中重要的自身抗原[9,10]。

Johansen等[5]检测156例RA患者的血清HCgp-39，发现54%的活动期患者血清HCgp-39水平升高，经治疗病情缓解的患者HCgp-39水平下降30%，缓解期患者病情再次活动时血清HCgp-39水平相应升高；RA患者如果疾病早期即出现HCgp-39高表达，提示其已出现关节损害的X线表现。在RA患者PBMC中也发现HCgp-39高表达，而正常人PBMC不表达此基因。研究发现，HCgp-39表达与RA活动性指标红细胞沉降率(ESR)、IgM-RF有关[11,12]。但Syversen等[13]报道，RA患者血清HCgp-39水平与其放射学改变无明显相关性；与上述报道不符，可能与所选病例及其病程、疾病分期和活动度不同有关。

目前尚没有HCgp-39用于RA临床应用的报道，但国内外学者已经在进行这方面的研究。Verheijden等[14]发现，HCgp-39能诱导BALB/C小鼠产生一种与RA极其相似的慢性复发性对称性关节炎。在免疫反应之前将HCgp-39注射至BALB/C小鼠鼻腔内，可导致抗原特异的T细胞免疫耐受，进而延缓或抑制关节炎症。Cope等[15]发现，HCgp-39刺激DRαβ*0401转基因小鼠的T细胞增殖，同样HCgp-39可以刺激HLA-DR4阳性的RA患者和健康对照者的T细胞增殖，而HLA-DR4阴性者则没有这样的反应。

本实验针对HCgp-39 mRNA的启动子下游序列，设计了两段siRNA，运用分子克隆技术，成功构建两段siRNA的真核表达载体并采用脂质体转染入RA患者PBMC中，观察其对 HCgp-39表达量及细胞增殖的影响。转染24 h，与对照组和空载体组相比，HCgp39-siRNA1组和HCgp39-siRNA2组HCgp39 mRNA表达均下降，提示所设计的两个载体阻断了HCgp39 mRNA表达，载体构建成功。倒置显微镜下观察发现，与对照组和空载体组相比，HCgp-39-siRNA1组与HCgp-39-siRNA2组细胞形态不规则，漂浮细胞增多，出现大量凋亡细胞团；HCgp-39-siRNA1组、HCgp-39-siRNA2组较对照组和空载体组细胞增殖明显减弱，间接说明HCgp-39可促进RA患者PBMC增殖。

综上所述，HCgp-39可促进RA患者PBMC增殖，HCgp-39作为炎症和退行性变的可能自身抗原可以为准备开发的RA联合靶标药物提供底物，通过RNAi技术特异性阻断HCgp-39表达可能从抗原特异免疫治疗方面为RA的治疗提供新的手段和方法。

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(收稿日期：2015-05-18)

中图分类号：R684

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)04-0079-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.031