乳腺癌组织中Cbl-b和Itch蛋白的表达变化及意义

韩明强，李建辉，闫静波,刘澄湘,崔占斌

(河北医科大学附属邢台市人民医院，河北邢台054000)



乳腺癌组织中Cbl-b和Itch蛋白的表达变化及意义

韩明强，李建辉，闫静波,刘澄湘,崔占斌

(河北医科大学附属邢台市人民医院，河北邢台054000)

摘要：目的观察Cbl-b和Itch蛋白在乳腺癌组织中的表达变化并探讨其意义。方法 选择116例乳腺癌患者术后标本和30例乳腺癌患者癌旁正常乳腺组织(距癌组织边缘5 cm)，应用免疫组化法检测Cbl-b和Itch蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征的关系。结果116份乳腺癌组织中Cbl-b和Itch蛋白的阳性表达率分别为78.45%(91/116)、58.62%(68/116)，30份癌旁正常乳腺组织中Cbl-b和Itch蛋白的阳性表达率分别为26.67%(8/30)、23.33%(7/30)。乳腺癌组织的表达均高于癌旁正常乳腺组织(P均<0.01)。Cbl-b、Itch蛋白表达与浸润深度、淋巴结转移及病理分期均呈正相关(r分别为0.172、0.119、0.117，0.145、0.134、0.138；P分别为0.014、0.022、0.017，0.028、0.027、0.025)；Cbl-b和Itch蛋白阳性表达与患病年龄、病灶大小无相关性(P均>0.05)。结论 乳腺癌组织中Cbl-b蛋白、Itch蛋白表达均升高，此二者参与乳腺癌的进展。

关键词：乳腺肿瘤；Cbl-b蛋白；Itch蛋白

Cbl-b和Itch蛋白均属于E3泛素连接酶家族，其通过调控免疫转导通路中一系列信号蛋白，诱导T细胞免疫无反应性，在肿瘤免疫和自体免疫性疾病中起着重要的负性调节作用[1]。研究表明，Cbl-b和Itch基因缺陷能显著促进T淋巴细胞活化，减少外周调节性T细胞增殖浸润，消除肿瘤免疫耐受微环境，增强机体抗肿瘤免疫杀伤力，因此以Cbl-b和Itch为靶向的肿瘤免疫治疗具有良好的应用前景[2]。目前国内外未见Cbl-b及Itch蛋白在乳腺癌组织中表达的报道。2010年3月~2014年6月，我们利用免疫组化法检测两种蛋白质在乳腺癌组织中的表达情况，并分析其与乳腺癌临床病理特征的关系，旨在探讨Cbl-b和Itch蛋白在乳腺癌组织中的表达变化及其临床意义。

1资料与方法

1.1临床资料收集本院行手术切除的116例乳腺癌患者的癌组织标本，符合卫生部2011年8月12日正式发布的《乳腺癌诊断》标准(WS338-2011)，均经病理检查确诊。病理类型均为乳腺浸润性导管癌，临床病理资料完整，术前未予以新辅助化疗。患者均为女性，年龄28～72岁、中位年龄53岁。参照美国癌症联合会2010年TNM分期标准[3]，其中T1期8例，T2期34例，T3期49例，T4期25例；发生淋巴结转移90例，N1期32例，N2期45例，N3期13例；病理分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期33例，Ⅲ期39例，Ⅳ期21例。116例乳腺癌患者中，选择其中的30例患者距癌组织边缘5 cm的正常乳腺组织作为对照。

1.2组织中Cbl-b和Itch蛋白的检测采用免疫组化法。 实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。用已知阳性对照片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。兔抗人Cbl-b和鼠抗人Itch单克隆抗体均购自美国BD公司，SABC检测试剂盒和DAB显色液均购自上海生物工程技术服务有限公司。判断标准：Cbl-b和Itch蛋白均以细胞膜和(或)细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞染色，阳性细胞计数百分比≤10%判定为阴性，﹥10%判定为阳性，判定表达程度以阳性细胞计数百分比为参考，<25%为+，25%~50%为++,51%~75%为+++，﹥75%为++++。-为阴性，+为弱阳性，++为中度阳性，+++～++++为强阳性。

1.3统计学方法采用SPSS15.0统计软件。计数资料以频数或百分比表示，Cbl-b和Itch蛋白表达与临床病理参数关系采用χ2检验，与参数间相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Cbl-b和Itch在乳腺癌组织中的表达116份乳腺癌组织中Cbl-b和Itch蛋白阳性表达率分别为78.45%(91/116)和58.62%(68/116)，30例癌旁正常乳腺组织中Cbl-b和Itch蛋白阳性表达率分别为26.67%(8/30)和23.33%(7/30)，两种蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率均显著高于癌旁正常乳腺组织(P均<0.01)。

2.2Cbl-b和Itch蛋白表达与乳腺癌临床病理参数的关系见表1。

表1　Cbl-b和Itch蛋白表达与乳腺癌临床病理参数的关系[例(%)]

2.3相关性分析Cbl-b表达与浸润深度、淋巴结转移及病理分期均呈正相关(r=0.172，P=0.014；r=0．119，P=0.022；r=0.117，P=0.017)；Itch蛋白表达与浸润深度、淋巴结转移及病理分期均呈正相关(r=0.145，P=0.028；r=0.134，P=0.027；r=0.138，P=0.025)。

3讨论

乳腺癌属于临床常见恶性肿瘤，据统计资料显示，乳腺癌发病率和病死率占美国全部女性恶性肿瘤总数的第1位，约41%[4]。过去认为乳腺癌属于非免疫源性肿瘤，对免疫治疗无明显效果。随着对乳腺癌发病机制研究的深入，证实乳腺癌在分子水平上存在免疫抑制状态[5]。研究[6]表明，乳腺癌组织内细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤组织的渗透活性及杀伤能力明显减弱，而Treg细胞等免疫抑制细胞活性增强，两者均构成乳腺癌免疫耐受基本要素。

Cbl-b和Itch蛋白是外周T细胞耐受的关键调节因子，在T细胞活化信号转导中具有广泛负调控作用。Cbl-b介导磷酸肌醇激酶催化亚基泛素化，改变其细胞内定位，阻断其与细胞膜表面分子CD28和T细胞受体结合，抑制核转录因子活化，从而最终影响CD8+T淋巴细胞活化增殖[7]。同时，Cbl-b基因敲除CD8+T细胞对由Treg细胞和TGF-β介导的免疫抑制作用不敏感[8]，因此通过抑制或敲除Cbl-b基因能产生有效的抗肿瘤免疫治疗作用。Itch在调节TGF-β信号和转录因子Foxp3在CD4+T细胞的表达中起着关键作用，Foxp3+Treg细胞能增强TGF-β的免疫抑制作用，Itch缺陷能显著影响TGF-β依赖的转录因子Foxp3表达，并解除TGF-β依赖的T细胞增殖抑制作用[9]。以上研究均提示Cbl-b和Itch蛋白参与机体抗肿瘤免疫的发生发展过程。

乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移的过程受多种因素的共同影响，而免疫因素就是其中的关键环节。肿瘤局部浸润、淋巴结转移及乳腺癌组织学分级均与乳腺癌患者预后呈负相关。乳腺癌细胞能诱导机体免疫耐受，逃避免疫监视，最终形成肿瘤转移，而Cbl-c、Cbl-b蛋白能介导乳腺癌在体内的侵袭转移[10]。Yan等[11]利用蟾毒灵降低Cbl-b表达可以明显增强肿瘤坏死因子的凋亡诱导配体功能，后者能诱导乳腺癌细胞凋亡，提示Cbl-b表达与乳腺癌细胞凋亡呈负相关。Kang等[12]研究证实，降低Cbl-b蛋白表达可显著增强TGF-β转录活性，而后者可促进乳腺肿瘤生长。同样，Itch在调节TGF-β信号转导中起关键作用，但目前尚未见Itch与乳腺癌生长及浸润转移相关报道。国内有研究证实，Cbl-b蛋白在非小细胞肺癌组织中阳性细胞率达84.0%[13]，在胃癌组织中阳性细胞率为82.3%[14]，且发现Cbl-b蛋白高表达与肿瘤的侵袭和发展有关。本研究结果表明，与正常乳腺组织相比，Cbl-b和Itch蛋白在乳腺癌组织中均高表达，并与肿瘤浸润程度、淋巴结转移和病理分期呈正相关，提示Cbl-b和Itch蛋白参与乳腺癌的进展。

总之，在乳腺癌组织中Cbl-b和Itch蛋白表达均升高，此二者与乳腺癌的进展有关，有可能成为乳腺癌新的肿瘤分子标志物；但本研究仍有不足之处，包括样本量不足、缺乏无病生存期和总生存期等长期临床随访资料，有待继续完善资料后研究证实。

参考文献：

[1] Venuprasad K. Cbl-b and itch: key regulators of peripheral T-cell tolerance[J]. Cancer Res, 2010,70(8):3009-3012.

[2] Paolino M, Thien CB, Gruber T, et al. Essential role of E3 ubiquitin ligase activity in Cbl-b-regulated T cell functions[J]. J Immunol, 2011,186(4):2138-2147.

[3] Keam B, Im SA, Lim Y, et al. Clinical usefulness of AJCC response criteria for neoadjuvant chemotherapy in breast cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2013,20(7):2242-2249.

[4] Desantis CE, Lin CC, Mariotto AB, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(4):252-271.

[5] Ascierto ML, Kmieciak M, Idowu MO, et al. A signature of immune function genes associated with recurrence-free survival in breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat[J]. Breast Cancer Res Treat, 2011,131(3):871-880.

[6] Denkert C, Loibl S, Noske A, et al. Tumor-associated lymphocytes as an independent predictor of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer[J]. J Clin Oncol, 2010,28(1):105-113.

[7] Qiao G, Li Z, Molinero L, et al. T-cell receptor-induced NF-kappaB activation is negatively regulated by E3 ubiquitin ligase Cbl-b[J]. Mol Cell Biol, 2008,28(7):2470-2480.

[8] Loeser S, Loser K, Bijker MS, et al. Spontaneous tumor rejection by cbl-b-deficient CD8 T cells[J]. J Exp Med, 2007,204(4):879-891.

[9] Venuprasad K, Huang H, Harada Y, et al. The E3 ubiquitin ligase Itch regulates expression of transcription factor Foxp3 and airway inflammation by enhancing the function of transcription factor TIEG1[J]. Nat Immunol, 2008,9(3):245-253.

[10] Nam JM, Onodera Y, Mazaki Y, et al. CIN85, a Cbl-interacting protein, is a component of AMAP1-mediated breast cancer invasion machinery[J]. EMBO J, 2007,26(3):647-656.

[11] Yan S, Qu X, Xu C, et al. Down-regulation of Cbl-b by bufalin results in up-regulation of DR4/DR5 and sensitization of TRAIL-induced apoptosis in breast cancer cells[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,138(8):1279-1289.

[12] Kang JM, Park S, Kim SJ, et al. CBL enhances breast tumor formation by inhibiting tumor suppressive activity of TGF-β signaling[J]. Oncogene, 2012,31(50):5123-5131.

[13] 焦昕,金波,曲秀娟,等.c-Cbl、Cbl-b和EGFR在非小细胞肺癌中的表达及其预后价值[J].中国肺癌杂志,2011,14(6):512-517.

[14] 董茜,刘云鹏,曲秀娟,等.c-Cbl、Cbl-b和EGFR在胃癌组织中的表达及其临床意义[J].癌症,2010,29(1):59-64.

Expression changes of Cbl-b and Itch in breast carcinoma and the clinical significance

HanMingqiang,LIJianhui,YANJingbo,LIUChengxiang,CUIZhanbin

(XingtaiPeople'sHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity，Xingtai054000，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes of Cbl-b and Itch in the breast carcinoma tissues and the clinical significance．MethodsThe expression of Cbl-b and Itch in 116 specimens of breast carcinoma and 30 specimens of normal breast tissues was detected by immunohistochemistry．Meanwhile, we also statistically analyzed its relationship with the clinical and pathological factors. ResultsThe positive expression rates of Cbl-b and Itch in the breast carcinoma tissues were respectively 78.45% (91/116) and 58.62% (68/116).The positive expression rates of Cbl-b and Itch in the normal tisseus were 26.67%(8/30) and 23.33%(7/30)．The positive expression rates of Cbl-b and Itch in the breast cancer tissues were higher than those of the normal tissues (all P<0.01).The positive expression of Cbl-b and Itch was positively correlated with depth of invasion, lymph node metastasis and TNM staging (r=0.172，P=0.014； r=0．119, P=0.022； r=0.117，P=0.017; r=0.145，P=0.028； r=0.134，P=0.027； r=0.138，P=0.025). The positive expression of Cbl-b and Itch was not related with age of patient and the lesion size (all P>0.05)．ConclusionThe expression of Cbl-b and Itch is increased in the breast cancer tissues, and both of them take part in the progress of breast carcinoma．

Key words:breast neoplasms; Cbl-b protein；Itch protein

(收稿日期:2015-06-09)

中图分类号：R737.9

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0015-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.005

作者简介：第一韩明强(1974-),男,副主任医师，主要从事乳腺、甲状腺疾病的基础与临床研究。E-mail:hanmingqiang@126.com

基金项目：河北省卫生和计划生育委员会2015年度医学科学研究重点课题(20150176)。