基于生命信息的春灌提高紫花苜蓿抗寒性作用研究

邬佳宾，苗 澍，焦 瑞，苗恒录，孙亚楠(. 水利部牧区水利科学研究所， 呼和浩特 0000；. 内蒙古大学， 呼和浩特 000)

农牧业生产中低温胁迫是影响作物产量和品质的主要非生物胁迫，尤其对于牧草，低温对牧草越冬期造成的寒害是导致牧草低产的关键因素。牧草的抗寒性主要受2个方面因素影响，分别是环境条件与牧草自身性能，前者主要包括水分、温度和光周期，后者主要是牧草的抗氧化能力、生长时期、发育水平等[1]。紫花苜蓿越冬期低温造成的冻害是生产上的一大威胁，不仅影响草地的持续高效利用，同时限制了栽培区域的发展。根系的抗寒性是决定紫花苜蓿安全越冬的首要因素之一，冷胁迫下植物可积累更多的可溶性糖、脯氨酸等营养物质，而这些生理指标与植物抗寒性关系密切[2]。研究表明，抗寒性强的紫花苜蓿品种受冻返青前可溶性糖升高而淀粉含量降低，说明苜蓿通过根部淀粉向糖的转化来提高自身的抗寒能力，因此可将可溶性糖作为评价抗寒能力的依据，游离脯氨酸含量的变化与可溶性糖类似[3]。不同品种紫花苜蓿抗寒能力的强弱同样表现于可溶性糖、游离脯氨酸含量等相关抗寒生理指标的高低，申晓慧等通过对不同紫花苜蓿品种抗寒生理特性的比较研究，确定了6种紫花苜蓿抗寒能力的大小[4]。即使同一品种苜蓿，由于处理的不同也会表现出抗寒性的差异，陈梓健等以紫花苜蓿“WL525”为试验材料，采用低温处理，表明MDA、POD、可溶性糖、相对电导率4个生理指标与该品种紫花苜蓿的抗寒性有密切联系，紫花苜蓿通过增加POD和可溶性糖的质量浓度来调节低温对其造成的伤害[5]。

作为一种抗寒性较强的植物品种，当紫花苜蓿受到低温胁迫时，其渗透调节物质等生命信息都会发生明显变化，而春灌可以改善苜蓿返青期根区环境，对于缓解低温胁迫的影响，帮助作物规避低温胁迫具有作用。早春土地开始解冻后，及时灌水，保持土壤湿润可以降低土温，延迟发芽萌动与返青，避免倒春寒危害，并能保证作物返青期的土壤墒情。春灌无疑改善了紫花苜蓿越冬期的环境条件，同时不同春灌条件下紫花苜蓿自身的抗寒性能也发生了变化。实践证明，通过灌水，增加紫花苜蓿关键生育期的土壤含水量能明显减轻苜蓿冻害程度，提高其越冬率[6,7]。本研究采用苜蓿返青期春灌这一简单易行的田间管理措施，试验测定紫花苜蓿返青期的生理生化指标，并结合产量等生命信息，分析和研究春灌条件下紫花苜蓿抗寒性变化，旨在探明春灌改善牧草越冬期低温胁迫的作用与机理，以期利用春灌改善紫花苜蓿生境条件，提高苜蓿抗寒越冬能力，增加其返青率，实现农牧业水资源的高效利用。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2014-2015年在中国水科院牧区水科所草地水土保持生态监测基地进行，行政区归属于包头市达尔罕茂明安联合旗东南部的希拉穆仁镇，地理位置为东经111°12′、北纬41°21′，海拔1 600 m。属大陆性季风气候，具有冬季漫长严寒，夏季短促温凉，寒暑变化强烈，昼夜温差大的特点，多年平均降雨量284 mm，且主要集中于7-9月，多年平均蒸发量2 305 mm；年平均气温2.5 ℃，多年平均日照时数3 100 h，无霜期83 d，多年平均风速4.5 m/s。

1.2 试验材料与方案设计

供试苜蓿品种为准格尔，来源于内蒙古自治区草原站。2014年春季完成苜蓿的播种，采用人工条播，行距30 cm，播种量15 kg/hm2，播深3cm，播后镇压。

春灌采用滴灌方式，灌溉次数为2次，灌水时间分别选择于2015年5月6-7日、5月17-18日，同年5月下旬苜蓿返青。灌溉水量分为高(G)、中(Z)、低(D)水量灌溉，另设不灌溉(B)处理。对应灌水量以田持的90%、70%、50%作为灌水上限。苜蓿其余生育期采用一致的田间管理措施，试验苜蓿为大田种植，每种处理设3个重复，共设置12个试验小区，每个小区面积为3.0 m×9.0 m，横向隔离带宽1.0 m，纵向隔离带宽0.5 m。

1.3 测定项目及方法

灌溉小区管道出口均设有水表用来读取春灌水量，并记录灌水时间。试验田苜蓿为第2年生，根据当地生产经验，2015年分别于7月5日、9月20日收获2茬，对不同处理分别进行测产。

2015年5月20日对不同灌水处理下苜蓿根系进行采样分析，对其6项生理指标进行测定，做5次重复。其中苜蓿根系渗透调节物质3项，组分及测定方法分别为游离脯氨酸含量测定采用茚三酮显色法，可溶性糖测定采用苯酚-硫酸法，丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度计法。测定苜蓿根系保护性酶指标2项，其中超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑法测定，过氧化物歧化酶(POD)采用愈创木酚法测定。采用TTC法测定越冬期苜蓿根系活力作为根系生长指标。

2 结果与分析

2.1 苜蓿根系渗透调节物质测定结果

在低温胁迫环境下，苜蓿体内积累各种渗透调节物质，使植株具有渗透调节的能力。植物在环境胁迫下，通过细胞内代谢活动，合成某些对原生质无伤害的渗透调节物质从而降低水势以平衡周围环境的胁迫。在低温胁迫下，细胞膜透性增大使细胞内大量物质渗出，此时苜蓿细胞内代谢加强，合成渗透调节物质降低细胞渗透势从而减轻细胞伤害。

2.1.1游离脯氨酸

脯氨酸含量是一种衡量苜蓿抗寒性的重要生理生化指标。处于低温等逆境时，植物体内会积累与抗逆性相关的游离脯氨酸。植物体内的游离脯氨酸进行有效的渗透调节作用，维持原生质与环境的渗透平衡，以保持细胞内环境的相对稳定。苜蓿植株体内脯氨酸的含量增加有利于提高其抗寒性[8]，并且随着低温胁迫时间的延长，苜蓿体内游离脯氨酸绝对含量逐渐增加[9]。

苜蓿根系游离脯氨酸含量采用茚三酮显色法在实验室提取，首先通过实验制作脯氨酸标准曲线，然后通过测定样品测定液的吸光度值，结合标准曲线查出样品测定液中脯氨酸的含量，并最终通过下式计算样品中脯氨酸的质量分数：

F=(CV)/(aW)

(1)

式中：F是样品中脯氨酸的质量分数；C是提取液中脯氨酸的质量，μg，由标准曲线求得；V是提取液总体积，mL；a是测定时所吸取的体积，mL；W是样品重，g。

测定结果详见表1。

表1 苜蓿根系生理指标测定结果

2.1.2可溶性糖

植物体受低温胁迫初期，细胞内可溶性糖含量的增加可帮助其适应低温环境[10]。伴随环境温度下降，苜蓿细胞内大分子物质发生水解从而增加可溶性糖，可溶性糖含量越大苜蓿的抗寒能力越强。苜蓿根及根茎中可溶性糖的积累与其抗寒及越冬性呈显著的正相关[11]。

可溶性糖含量采用苯酚-硫酸法测定，其原理是多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。主要的实验步骤包括标准品溶液的制备、标准曲线的制作、样品中可溶性糖的提取和测定。

吸取0.5 mL样品液于试管中，加蒸馏水0.5 mL，按顺序分别加入1 mL的50 g/L苯酚溶液，5 mL浓硫酸，显色并测定吸光度，有回归方程求出葡萄糖的量，按照下列公式计算样品中可溶性糖的含量。

(2)

式中：Ssc是可溶性糖含量，μg/g；C是回归方程求得的葡萄糖含量，μg；VT是提取液定容体积，mL；V1是吸取样品液体积，mL；M是称取样品的质量，g。

测定结果详见表1。

2.1.3丙二醛

苜蓿在逆境中受到伤害，伴随发生膜脂过氧化作用，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是这一作用的最终分解产物，因此越冬期苜蓿根部的MDA含量能够代表膜脂过氧化的程度，从而间接反映苜蓿抗寒能力的强弱。

采用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法测定，其原理是丙二醛(MDA)与TBA在酸性和高温条件下反应生成红棕色的三甲川，并在532nm处有最大光吸收，在600 nm处有最小光吸收。但是糖与TBA显色反应产物在532 nm处也有吸收(最大吸收峰在450nm处)，测定植物组织中的MDA时会受可溶性糖等多种物质的干扰，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。已知蔗糖与TBA显色反应产物在450和532 nm波长下的比吸收系数分别为85.40和7.400；MDA在450 nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为零，532 nm波长下的比吸收系数为155 000。根据双组分分光度计法建立方程组如下。

c1=11.71A450

(3)

c2=6.45 (A532-A600)-0.56A560

(4)

式中：c1是可溶性糖的浓度，mmol/L；c2是MDA的浓度，μmol/L；A450、A532、A600分别代表450、532和600 nm波长下的消光度值。

通过上述方程组求得苜蓿根系样品提取液中可溶性糖、MDA的浓度，根据植物组织的质量计算测定样品中MDA的质量摩尔浓度：

MMDA=cN/W

(5)

式中：MMDA是MDA质量摩尔浓度，μmol/g；c是MDA体积摩尔浓度，μmol/L；N是提取液体积，mL；W是植物组织鲜重，g。

测定结果详见表1。

2.2 苜蓿根系保护酶的变化

低温胁迫下，植物体内超常积累活性氧自由基，引起膜脂过氧化导致冷伤害[12]。而植物体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物歧化酶(POD)等保护酶系统具有清除活性氧自由基的功能，以减轻活性氧对植物的伤害[13]。测定苜蓿根系保护酶的含量，可以反映出其越冬期抵御低温的能力。

2.2.1超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)是植物抗氧化系统的第1道防线，是酶促清除系统的核心酶。逆境中的许多植物，其体内SOD的活性都发生了变化[14]，当然苜蓿也不例外。SOD的高活性避免了活性氧自由基的大量积累，有利于苜蓿细胞膜的稳定，从而提高苜蓿的抗寒性。

超氧化物歧化酶采用氮蓝四唑法测定，不同处理下超氧化物歧化酶活性测定结果详见表1。

2.2.2过氧化物歧化酶

过氧化物歧化酶(POD)采用愈创木酚氧化法测定。测定结果详见表1。

2.3 苜蓿根系活力的对比

根系是牧草重要的吸收与合成器官，根系的生长状况及其活力水平直接影响牧草的品质和产量。苜蓿作为宿根牧草，主要依赖根部的活力渡过越冬期，所以，苜蓿根系活力在很大程度上不仅能衡量其生长状况，更能反映出植株抗寒性的强弱。研究表明，宿根花卉、野牛草、玉簪等植物在低温胁迫下，根系活力均与植物抗寒性呈显著的相关关系。可见根系活力是衡量植物抗寒性的重要指标。

研究中采用TTC法测定根系活力。氯化三苯基四氮唑(TTC)是可溶于水的氧化还原物质，但被还原后即生成红色而不溶于水的TTF，而TTF的还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。具体步骤主要包括定性测定和定量测定。定性测定首先确定苜蓿根系样品有脱氢酶存在；定量测定则包括TTC标准曲线的制作和四氮唑还原强度的计算，四氮唑还原强度可用来表示根系活力。四氮唑还原强度公式如下：

RA=CTTF/(1 000WRH)

(6)

式中：RA是根系活力，mg/(g·h)；CTTF是四氮唑还原量，μg；WR是根重，g；H是时间，h。

测定结果详见表1。

研究结果显示，融冻水灌溉条件下，苜蓿根系活力均有不同程度提高，其中以中水量灌溉处理，根系活力增加幅度最大。根系活力的测定结果说明采用融冻水灌溉措施可切实提高苜蓿抗寒性，当以70%田持作为灌水量下限时根系活力获得了较大幅度的提升。

2.4 苜蓿测产结果

2015年试验田苜蓿为第2年生苜蓿，根据当地生产经验收获2茬，第1茬收获为2015年7月5日，第2茬收获为2015年9月20日。对各处理分别进行测产，结果见表2。

表2 不同春灌条件下紫花苜蓿测产结果 kg/hm2

从表2可以看出，不同春灌处理下苜蓿均有一定程度的增产，其原因在于苜蓿返青期良好的土壤墒情提高了苜蓿的成活率，并促进了苜蓿苗期的生长发育。春灌的中灌与高灌两种处理其最终产量较为接近，而中灌产量略高于高灌产量。

3 讨论与结论

3.1 融冻水灌溉条件下苜蓿抗寒性评价

融冻水灌溉后，苜蓿根系生理生化指标发生一系列变化，根据植物生理学理论，指标高低与苜蓿抗寒性密切相关，但是各指标之间具有相互协同作用，采用综合打分来确定最优灌水量，计分规则为以不灌水处理为对照，每一项指标的变化方向符合植物抗寒性理论即可得分，不符合植物抗寒性理论不得分，按照组分的变化强度由强到弱依次得分3、2、1分。得分表见表3。

表3 苜蓿根系生理指标综合得分

注：①越高抗寒能力越强；②越低抗寒能力越强。

综合比较可以看出，中水量灌溉对苜蓿抗寒性的提高效果最好，因此认为融冻水灌水量应以70%田间持水量为宜，实践中，滴灌模式下，融冻水灌溉以2次为宜。

3.2 基于产量的融冻水优化灌溉模式评价

由测产结果可以看出，春灌条件下苜蓿的产量明显高于对照处理，笔者认为，春季土壤墒情较差，不利于苜蓿返青和成活率的提高，春灌恰恰能为苜蓿提供良好的生境条件。同时，试验区5-6月冷空气活动较为频繁，苜蓿冻害时有发生，而苜蓿根系抗寒性生理指标的测定结果表明，春灌条件下，苜蓿的抗寒性有较大幅度的增强，有助于苜蓿返青期的生长发育和抵御倒春寒。

3种春灌水量的产量对比可以看出，中水量(70%田持)和高水量(90%田持)春灌条件下产量较高，中水量春灌处理苜蓿产量略高于高水量春灌处理，结合苜蓿抗寒性生理指标得分，初步认为春灌采用中水量灌溉为较优模式。

3.3 结论与展望

春灌条件下，返青期苜蓿根系可溶性糖呈现出随灌溉水量的增加而增加的趋势，由于可溶性糖含量越大苜蓿的抗寒能力越强，说明融冻水灌溉增强了苜蓿的抗寒能力。MDA是苜蓿逆境伤害的产物，在融冻水灌溉条件下，返青期苜蓿根系中MDA含量下降，侧面反映出融冻水灌溉有助于苜蓿抗寒性的提高。在3种灌水处理下，根系活力均有提升，其中以中水量灌溉处理提升幅度最大，达到169.74%，更直接说明融冻水灌溉提高了苜蓿抗寒性。通过不同灌溉水平的融冻水灌溉试验，从可溶性糖、丙二醛、根系活力3个方面证明，融冻水灌溉可以显著提高苜蓿的抗寒性。研究结果表明，低、中、高3种灌溉水量处理中，以中水量灌溉效果最佳。

春灌采用中水量灌溉模式获得了较高的产量，通过不同数据的综合比较，初步确认春灌中水量灌溉为是苜蓿春灌的较优灌溉模式。在应用过程中应注意与当地苜蓿生育期相结合，融冻水灌溉不宜过早。

伴随着我国农牧业产业结构不断调整和种草畜牧业的迅速发展，紫花苜蓿的种植区域不断扩大，这些区域地形复杂，气候多样，苜蓿越冬除需适应低温胁迫，还面临干旱、盐渍化等多种环境胁迫。要解决苜蓿安全越冬这一问题，就需要对其抗逆机理进行深入研究。多年来随着对苜蓿抗寒性研究的逐步深入，对其适应低温胁迫的机理有了一定的认识，但如何保证苜蓿安全越冬才是我们的目的所在。为了减轻冻害，有条件的地区可以通过灌水、覆土、调整种植制度等措施帮助苜蓿安全越冬。改良育种也是保证苜蓿安全生产的一项重要措施，在引进国外优良苜蓿品种的同时，积极培育和改良适合我国地理环境的苜蓿品种。利用传统育种技术，我国先后于育成了多种耐寒品种，但由于常规育种周期长、成本高，尚不能完全满足苜蓿生产的需要。近年来分子生物学、生物化学技术不断发展，为抗寒机理和改良育种提供了有效的技术支撑，尽管基因工程可迅速提高苜蓿的抗寒越冬能力，但是考虑到安全性、稳定性等因素，转基因苜蓿大多还停留在试验阶段，尚未进入生产应用，同时常规育种与现代育种技术还未有机结合。在未来的研究中应将多层次的方法、技术结合起来，充分关注并切实提高苜蓿的抗寒越冬能力。

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