冬季低温条件下香石竹小孢子败育的细胞学研究

周旭红,蒋亚莲,李姝影,苏　艳,莫锡君,桂　敏

(云南省农业科学院花卉研究所,云南省花卉育种重点实验室,国家观赏园艺工程技术研究中心,昆明 650205)



冬季低温条件下香石竹小孢子败育的细胞学研究

周旭红,蒋亚莲,李姝影,苏艳,莫锡君,桂敏*

(云南省农业科学院花卉研究所,云南省花卉育种重点实验室,国家观赏园艺工程技术研究中心,昆明 650205)

摘要:利用压片法及石蜡切片法观察冬季低温下香石竹小孢子发育过程,以明确低温导致香石竹小孢子败育的因素,为杂交育种奠定基础。结果表明:(1)冬季低温下香石竹只有部分小孢子发育正常,经过小孢子母细胞、减数分裂和四分体等时期,最后发育成花粉。(2)石蜡切片法观察到冬季低温下香石竹1.5～1.6 cm长花蕾中有61 %的花粉母细胞发生败育,1.7～1.8 cm长花蕾中有71%的花粉母细胞发生败育。(3)部分已经进入四分体时期的小孢子胼胝质未能及时溶解,妨碍了小孢子释放而导致败育。研究认为,花粉母细胞和四分体的发育异常是冬季低温下香石竹小孢子败育的主要原因。

关键词:低温;香石竹;花粉;败育

香石竹(DianthuscaryophyllusL.)是云南及全球主栽的鲜切花之一。目前,绝大多数香石竹品种依赖国外进口,缺乏拥有自主知识产权的新品种是制约中国花卉产业发展的重要因素,培育占有一定市场份额的新品种是亟待解决的主要问题。

香石竹杂交一般在每年的4～10月份进行(北方的杂交时间更短),到了冬季气温下降不适合进行杂交育种。当气温在10～17 ℃时,绝大多数香石竹无雄蕊或雄蕊发育不全,花粉败育[1]。傅小鹏等[2]研究石竹雄性不育系小孢子败育的原因,发现不育系败育现象在造孢细胞增殖期、小孢子母细胞减数分裂期以及四分体至单核期都有发生,不育花粉外形空瘪,不规则,无生活力。绒毡层的异常发育是导致小孢子败育的主要原因。而香石竹冬季低温花粉败育的原因很少有人报道,本研究采用压片法及石蜡切片观察冬季香石竹小孢子发育过程,探讨小孢子败育的原因,可为阐明其不育机理提供细胞学资料,为合理利用种质资源、利用杂交优势进行新品种选育提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料

供试材料为香石竹品种‘Promesa’,取自云南省农业科学院花卉研究所宝峰基地。

1.2方法

1.2.1花粉活力测定采用醋酸洋红染色测定法。分别于2013年3月、6月、9月和12月取3朵香石竹花的花药放入干燥皿中过夜干燥,将花药置于载玻片上,挤压后去除杂质,加2～3滴1%醋酸洋红溶液,盖上盖玻片,在显微镜下观察。统计花粉的活力及花粉直径,SPSS 18.0软件计算均值和标准差。

花粉生活力=(着色花粉数/观察花粉数)×100%

1.2.2压片法观察小孢子发育2013年12月选取生长发育正常的植株,取香石竹不同长度的花蕾,重复3～4朵花,长度分别为0.9～1.0、1.1～1.2、1.3～1.4、1.5～1.6、1.7～1.8、1.9～2.0、2.1～2.2和2.3～2.6 cm的花蕾,用FPA固定液(福尔马林∶丙酸∶70%酒精=1∶1∶18)固定,用清水漂洗3次,60 ℃ 1 mol/L HCl酸解10 min,清水漂洗3次,卡宝品红染色30 min后压片,在光学显微镜下观察花粉母细胞减数分裂过程。统计不同长度的花蕾四分体时期一分体、二分体、三分体和四分体的个数,采用SPSS 18.0软件作图。

1.2.3石蜡切片法观察小孢子发育2013年12月用FPA固定液固定不同长度的花蕾,重复3～4朵花。将固定的花蕾,用清水洗净2次后,滴上苏木素染液,染色12 h。将染液洗净,用70%乙醇洗2次,每次10 min,用70%乙醇浸泡材料12 h。再经过逐级脱水,透明,浸蜡及包埋等步骤,最后切片,切片厚度8～12 μm,Nikon E800显微镜观察和拍摄。统计不同长度的花蕾,小孢子处于不同发育时期的细胞的百分率,采用SPSS 18.0软件作图。

2结果与分析

2.1不同季节花粉的活力

由表1可以看出,不同季节香石竹‘Promesa’的花粉活力差异显著,其中在3月和12月的花粉活力(22.23%和21.60%)显著低于6月和9月(70.82%和71.41%),而且6月和9月为高温季节,温度分别为22.84 ℃和21.17 ℃;3月和12月属低温季节,温度分别为14.12 ℃和14.48 ℃。说明温度可能是影响香石竹花粉活力的因素之一。

2.2压片法观察冬季香石竹小孢子发育过程

冬季香石竹‘Promesa’花蕾长0.9～1.2 cm时,小孢子发育处于花粉母细胞时期,小孢子母细胞的细胞质浓厚、液泡小、细胞核大(图版Ⅰ,A、B);随之小孢子母细胞之间形成胼胝质壁,逐渐增大,进入减数分裂时期(花蕾长1.3～1.4 cm;图版Ⅰ,C);当花蕾1.5～1.6 cm时,小孢子减数分裂形成的四分体由胼胝质包围(图版Ⅰ,D),并出现异常的二分体(图版Ⅰ,E)和三分体(图版Ⅰ,F),有部分仍处于减数分裂阶段(图版Ⅰ,G);1.7～1.8 cm长花蕾,部分小孢子处于四分体时期(图版Ⅰ,H);花蕾发育到1.9～2.0 cm时,少数发育为单核期小孢子,但仍有部分小孢子处于四分体时期,(图版Ⅰ,I～J);当花蕾长2.1～2.6 cm时,小孢子发育为成熟的花粉(图版Ⅰ,K～L)。

表1　不同季节香石竹‘Promesa’花粉活力

注:同列不同字母表示差异显著(P≤0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant differences(P≤0.05).

由图1可以看出,3月(春季),香石竹‘Promesa’四分体时期出现在1.3～1.8 cm长的花蕾中,花蕾长1.3～1.6 cm时,以四分体居多,其它分体只占少量的比例;花蕾长1.7～1.8 cm时,四分体和二分体所占比例较大。到6月(夏季),香石竹‘Promesa’四分体时期出现在1.3～1.6 cm长的花蕾中,且主要是四分体细胞。9月(秋季)1.5～1.6 cm长的花蕾为小孢子四分体时期,绝大部分是四分体细胞。到了12月(冬季),1.5～2.0 cm长的花蕾观察到四分体,1.5～1.6 cm长的花蕾绝大部分是四分体细胞,1.7～2.0 cm长的花蕾四分体和其它分体都占有一定的比例。由此可见,高温季节(6月和9月),花蕾长1.7 cm时,四分体时期已结束;而低温季节(3月和12月),在花蕾长1.7～1.8 cm或1.7～2.0 cm时还有部分花粉母细胞处于四分体时期,可能的原因是低温引起四分体时期胼胝质不能及时解体,小孢子未能释放出来。

A.3月;B.6月;C.9月;D.12月

2.3石蜡切片法观察冬季香石竹小孢子发育过程

冬季香石竹‘Promesa’花蕾长0.9～1.2 cm时处于花粉母细胞时期,细胞核大且细胞质浓,此时花药壁由外向内分化为表皮、药室内壁、中层和绒毡层,绒毡层细胞排列整齐具一至多核,细胞质浓厚(图版Ⅱ,A、B);1.3～1.4 cm长花蕾94%的小孢子处于花粉母细胞(图版Ⅱ,C)和6%的小孢子进行减数分裂(图版Ⅱ,D;图2);1.5～1.6 cm长花蕾中,22%小孢子处于花粉母细胞时期(图版Ⅱ,E),61%花粉母细胞发生败育(图版Ⅱ,F),13%小孢子仍处于减数分裂时期(图版Ⅱ,G),只有4%小孢子母细胞完成正常的减数分裂,分裂完成时在 4个核间产生细胞壁,并分隔成由胼胝质所包围的 4 个细胞,形成正四面体形的小孢子四分体,4个小孢子处于共同的胼胝质中(图版Ⅱ,H;图2);1.7～1.8 cm长花蕾中71%花粉母细胞发生败育(图版Ⅱ,I),29%处于四分体时期(图版Ⅱ,J;图2);62%的1.9～2.0 cm长花蕾形成花粉,随着胼胝质壁溶解,四分体分开形成单核小孢子,并在原小孢子初生壁的基础上形成真正的外壁。起初形成的单核小孢子细胞质浓,核大并居中,它们聚集在药室的中央,绒毡层开始降解(图版Ⅱ,K),另有38%小孢子还处于四分体阶段,胼胝质壁并未溶解(图版Ⅱ,L);2.1～2.6 cm长,小孢子细胞质中小孢子壁的增厚,残余的绒毡层细胞则逐渐脱离花药壁,作为营养被发育中的小孢子所吸收,花粉粒逐渐发育成熟(图版Ⅱ,M～O)。由图2可见,0.9～1.4 cm长花蕾中,绝大多数减数分裂细胞处于花粉母细胞时期,1.5～1.8 cm长花蕾中,花粉母细胞时期开始败育,少数花粉母细胞进入四分体时期,1.9～2.6 cm长花蕾中,四分体开始解体,形成单核小孢子,并逐渐发育成熟。冬季低温可能影响减数分裂时期花粉母细胞的发育。

图2　冬季不同大小香石竹花蕾中不同时期

3讨论

雄性不育材料类型不同,花粉败育的时期和原因也不尽相同。辣椒不育系8A败育时期发生在四分体时期,进入四分体时期,绒毡层细胞径向异常膨大高度液泡化并入侵药室,挤压形成不规则的四分体,皱缩凹陷,有的小孢子四分体还出现粘连现象,不能产生正常小孢子[3]。甘蓝型油菜不育系105A的花药败育是由于一部分花药发育受阻于造孢细胞时期,另一部分花药发育受阻于单核晚期[4]。张文超等[5]发现,胼胝质的异常合成与分布是毛白杨花粉败育的原因之一。石竹花粉败育现象在造孢细胞增殖至小孢子母细胞进行减数分裂以及释放小孢子形成的各个阶段都有发生[2]。

本研究发现冬季香石竹品种‘Promesa’花粉活力低,石蜡切片观察到1.5～1.6 cm长花蕾中,61%花粉母细胞发生败育,1.7～1.8 cm长花蕾中有71%花粉母细胞发生败育,小孢子花粉母细胞的败育集中在1.5～1.8 cm长花蕾中,花粉母细胞发生败育是冬季香石竹品种‘Promesa’花粉败育的主要原因。此外,3月和12月四分体时期分别出现在长为1.3～1.8 cm和1.5～2.0 cm的花蕾,而6月和9月四分体时期分别出现在长为1.3～1.6 cm和1.5～1.6 cm的花蕾中。由此可见,高温季节四分体时期时间较短,而低温季节四分体时期时间较长,四分体时期胼胝质未能及时解体,从而导致小孢子不能释放出来。综上,低温可能导致花粉母细胞发生败育以及胼胝质不能及时溶解,进而致使小孢子的败育,这还需更进一步证实。

参考文献:

[1]KHO Y O,BAER J.The effect of temperature on pollen production in carnations[J].Euphytica,1973,22(3):467-470.

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[4]王开芳,张咏梅,张金文,等.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系105A花药败育的细胞学观察[J].中国农学通报,2015,31(13):76-80.

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[5]张文超,曹媛,常童洁,等.毛白杨花粉败育过程中胼胝质的异常分布变化[J].东北林业大学学报,2013,41(1):68-71.

ZHANG W C,CAO Y,CHANG T J,etal.Abnormal changes of callose distribution during pollen abortion inPopulustomentosaCarr[J].JournalofNortheastForestryUniversity,2013,41(1):68-71.

Explanation of plates:

Piate ⅠDevelopmental stages of the carnation anther in different length of buds by squash observation in winter

Fig.A.Microspore mother cell in 0.9-1.0 cm bud;Fig.B.Microspore mother cell in 1.1-1.2 cm bud;Fig.C.Meiotic cell in 1.3-1.4 cm cm bud;Fig.D.Tetrad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.E.Dyad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.F.Triad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.G.Meiotic cell in 1.5-1.6 cm cm bud;Fig.H.Tetrads in 1.7-1.8 cm bud;Fig.I.Tetrad and uninuclear microspore in 1.9-2.0 cm bud;Fig.J.Tetrad in 1.9-2.0 cm bud;Fig.K.Mature pollen in 2.1-2.2 cm bud;Fig.L.Mature pollen in 2.3-2.6 cm bud.

Piate ⅡDevelopmental stages of the carnation anther in different length of buds by section observation in winter

Fig.A.Microspore mother cell in 0.9-1.0 cm of bud;Fig.B.Microspore mother cell in 1.1-1.2 cm of bud;Fig.C.Microspore mother cell in 1.3-1.4 cm of bud;Fig.D.Meiotic cell in 1.3-1.4 cm of bud;Fig.E.Microspore mother cell in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.F.Abortion in microspore mother cell of 1.5-1.6 cm bud;Fig.G.Meiotic cell in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.H.Tetrad in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.I.Abortion in microspore mother cell of 1.7-1.8 cm bud;Fig.J.Tetrad in 1.7-1.8 cm of bud;Fig.K.Microspore in 1.9-2.0 cm of bud;Fig.L.Tetrad in 1.9-2.0 cm of bud;Fig.M.Mature pollen in 2.1-2.2 cm of bud;Fig.N.Mature pollen in 2.1-2.2 cm of bud;Fig.O.Mature pollen in 2.3-2.6 cm of bud.

图版 Ⅰ冬季香石竹不同长度花蕾小孢子的发育特征(压片法)

A.0.9～1.0 cm长花蕾花粉母细胞时期;B.1.1～1.2 cm长花蕾花粉母细胞时期;C.1.3～1.4 cm长花蕾减数分裂时期;D.1.5～1.6 cm长花蕾四分体细胞;E.1.5～1.6 cm长花蕾二分体细胞;F.1.5～1.6 cm长花蕾三分体细胞;G.1.5～1.6 cm长花蕾减数分裂时期;H.1.7～1.8 cm长花蕾四分体细胞;I.1.9～2.0 cm长花蕾四分体时期和单核期细胞;J.1.9～2.0 cm长花蕾四分体时期;K.2.1～2.2 cm长花蕾成熟的花粉粒;L.2.3～2.6 cm长花蕾成熟的花粉粒。

图版 Ⅱ冬季香石竹不同长度花蕾小孢子的发育特征(石蜡切片法)

A.0.9～1.0 cm长花蕾花粉母细胞时期;B.1.1～1.2 cm长花蕾花粉母细胞时期;C.1.3～1.4 cm长花蕾花粉母细胞;D.1.3～1.4 cm长花蕾减数分裂时期;E.1.5～1.6 cm长花蕾花粉母细胞;F.1.5～1.6 cm长花蕾花粉母细胞发生败育;G.1.5～1.6 cm长花蕾减数分裂细胞;H.1.5～1.6 cm长花蕾四分体时期;I.1.7～1.8 cm长花蕾花粉母细胞发生败育;J.1.7～1.8 cm长花蕾四分体细胞;K.1.9～2.0 cm长花蕾形成花粉;L.1.9～2.0 cm长花蕾四分体细胞;M.2.1～2.2 cm长花蕾成熟的花粉粒;N.2.1～2.2 cm长花蕾成熟的花粉粒;O.2.3～2.6 cm长花蕾成熟的花粉粒。

(编辑:潘新社)

Cytological Research on Microspore Abortion ofDianthuscaryophyllusunder Low Temperature Environment in Winter

ZHOU Xuhong,JIANG Yalian,LI Shuying,SU Yan,MO Xijun,GUI Min*

(Flower Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Science,Key Laboratory of Flower Breeding of Yunnan Province,National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture,Kunming 650205,China)

Abstract:The mechanism of pollen abortion of Dianthus caryophyllus was studied under low temperature environment in winter for further research hybrid breeding.Microsporogenesis process of male sterile was histologically examined using squash technique and paraffin embedded method.The results demonstrated:(1)only few mature pollen grains in winter was followed through the initiation of the microsporocyte formation,meiosis and the tetrad developmental period,finally formed pollen.(2)61% pollen mother cells aborted in 1.5-1.6 cm of buds and 71% pollen mother cells aborted in 1.7-1.8 cm of buds.(3)Furthermore,the portion of callose of tetrad could not dissolve resulting in microspores unreleased into the chamber.In brief,abnormal pollen mother cell and tetrad are the main cause of microspore in low temperature of winter.

Key words:low temperature;carnation;pollen;abortion

中图分类号:Q944.58

文献标志码:A

作者简介:周旭红(1978-),女,硕士,副研究员,主要从事花卉遗传育种研究工作。E-mail:zhouxuhong7801@126.com*通信作者:桂敏,研究员,主要从事花卉遗传育种研究工作。 E-mail:gming-114@163.com

基金项目:国家自然科学基金(31460530,31260491);国家观赏园艺工程技术研究中心(2012FU125X10);云南省应用基础研究计划(2014FA044);院创新团队(2014CZYY019);云南省中青年学术和技术带头人培养项目

收稿日期:2015-08-19;修改稿收到日期:2015-11-01

文章编号:1000-4025(2016)01-0037-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0037