点阵激光干预黄褐斑小鼠模型c—kit表达的研究
2016-03-22李波谭军钟茜李高峰吴维子
李波 谭军 钟茜 李高峰 吴维子
[摘要]目的：检测点阵激光治疗前后黄褐斑实验动物皮损中c-kit的变化，探讨点阵激光对黄褐斑的治疗机理。方法：建立黄褐斑实验动物模型，应用点阵激光干预动物模型。应用免疫组化染色方法检测治疗前后c-kit表达的变化，使用医学图像定量分析系统定量检测各标本中c-kit的阳性染色指数（pos it ive
index，PI）。结果：c-kit在黄褐斑小鼠模型中呈强阳性表达，点阵激光干预侧c-kit表达明显低于未干预侧，P<0.05。结论：点阵激光可能通过减少或抑制c-kit表达从而达到治疗黄褐斑的目的。
[关键词]点阵激光；黄褐斑；小鼠模型；C-kit
[中图分类号]R758.4+2
[文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）02-0030-03
黄褐斑是发生在颜而部的色素沉着斑，多发生于女性，皮损对称性分布于颜而、额、而颊、鼻背、唇周及颏部皮肤；形态不规则，呈淡褐色或暗褐色，边界明显或模糊不清，常呈大片状分布。其病因复杂，目前并不完全清楚，现认为是多种因素综合的结果。其主要因素有：过度接触紫外线，内分泌失调，情绪情感因素，遗传等。该疾病也是美容皮肤科治疗的重点和难点之一。目前点阵激光是皮肤美容医学研究的热点，有学者应用点阵激光治疗黄褐斑取得了良好的疗效，但也有学者质疑其效果，同时对于点阵激光治疗黄褐斑的机制并不清楚。近来，有研究显示c-kit与黑素合成关系密切，并发现c-kit在许多色素性疾病中表达明显增高，通过与其配体干细胞因子（stem cell factor，SCF）的结合，使黑素细胞内酪氨酸酶的表达增加、活性增强，黑素合成增加。
笔者应用雌激素与UVB联合刺激白色小鼠建立黄褐斑动物模型，并应用点阵激光干预，检测治疗后c-kit表达的变化并与未干预组对比，以期了解点阵激光治疗对病损皮肤c-kit表达的影响。
1 资料和方法
1.1 动物模型制作、取材与干预
选取健康成年雌性白色小鼠25只，通过对实验小鼠进行紫外线背部特定部位祛毛后照射、注射黄体酮和慢性应激抑郁刺激法综合作用建立小鼠黄褐斑实验动物模型，其中5只对照背部左右侧造模前后均取材。其余20只以低能量点阵CO2激光治疗左侧皮损区，取对侧作为对照，激光干预后背部两侧每日外用四环素油膏lOd，4次/d，术后3周杀死所有小鼠，取背部皮损区标本。
1.2 设备与参数
美国科医人公司生产Encore ActiveFXTM CO2点阵激光设备，参数：30mJ/c㎡，40HZ，1-3-3，CPG模式。
1.3 免疫组织化学染色观察
所有标本经福尔马林固定、脱水、包埋后，4μm厚石蜡切片，60℃烤片4-8h，石蜡切片脱蜡至水，加入0.Olmmol/l pH6.O柠檬酸缓冲液，微波处理lOmin，2次；蒸馏水洗，浸入PBS液中5min，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性。每张切片加入兔抗鼠单克隆c-kit抗体，1：100稀释，4℃孵育过夜，PBS冲洗，5mln 3次，加入PV-6000通用型免疫组化二步法检测试剂盒，37℃孵育20min，PBS冲洗，5min 3次，然后将切片置于AEC显色液中显色20min；蒸馏水冲洗，苏木素复染5s，水溶性封片剂封片。应用PBS替代兔抗鼠c-kit抗体作阴性对照。
按照曹芳等的方法：采用MioAS医学图像定量分析系统对免疫组织化学切片行定量分析。c-kit阳性产物位于胞浆内呈现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒均为阳性表达。MioAS在光镜400倍，电压3.66V、电流2.27A条件下，每张切片随机选取3个高倍视野，每个视野必须包括表皮全层与部分真皮，并将胞浆内或ECM出现淡黄色颗粒时界定为阳性染色强度（optical，density，OD）为1，此为OD低限，当出现棕黄色、棕褐色等染色颗粒时，计算机以OD为1时的染色强度为参照，测量出相应的OD值。同时将每个高倍视野而积划分为35.1万个像素点，1个像素点=0.039μ㎡，阳性染色而积（positive area，PA）以像素点表示。计算免疫组织化学阳性染色指数（positive index，PI），PI=PA×OD，每组示踪结果重复3次，取PI平均值作为c-kit的相对含量。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用配对t检验，P 2 结果 从切片与检测结果来看c-kit在未造模的正常白色小鼠上皮中表达较少，在大部分黄褐斑小鼠模型上皮中呈强阳性表达（图1）。点阵激光干预后，干预侧较未干预侧PI值明显降低，表示c-kit表达明显降低，P 3 讨论 黄褐斑是皮肤美容医学的难题，是多因素作用的结果，既往学者应用注射黄体酮或紫外线照射等方式来造模，这些造模方法只是单一的反应黄褐斑疾病的一种状态，近来已有学者开始应用多种干扰因素开始造模并获得成功，笔者应用此种因素制作黄褐斑模型较能正确反映黄褐斑的病理生理状态。 2004年Imokawa等提出皮肤黑色素细胞、角质形成细胞、成纤维细胞等能产生多种细胞因子并构成网络，互相协调，共同调节黑素颗粒的合成、成熟及转运等。干细胞因子（SCF）和其配体c-kit就是一对重要的细胞因子。SCF发挥作用需依赖于特定的配体（c-kit）形成配基受体二聚体复合物，从而启动相应的信号传导通路，调控细胞的各种生物学行为。c-kit作为III型跨膜蛋白酪氨酸激酶受体蛋白家族成员之一，已发现其在黑色素生成、造血、肥大细胞发育及功能等方面均发挥着重要的作用。皮肤中SCF和c-kit主要由角质形成细胞与成纤维细胞分泌，SCF与其配体c-kit结合后，后者能迅速催化自身磷酸化，促进配基受体二聚物的形成，并磷酸化胞浆内信号分子，依次激活酪氨酸激酶、酪氨酸酶，转化酪氨酸为黑色素。
研究证实SCF/KIT途径在维持黑色素细胞的存活、诱导迁移、调节黑色素细胞的增殖与黑色颗粒的合成中起了极为关键的作用。Kang等认为：黄褐斑病损皮肤组织中SCF（干细胞因子）和其配体c-kit的高表达是导致色素沉着的重要因素。李菲等在比较了黄褐斑、黑变病和炎症后色素沉着皮损中c-kit受体的表达后，发现黄褐斑中c-kit受体的表达较另两组显著增高，并认为c-kit受体可能在黄褐斑的色素沉着中起着重要的调控作用。
随着点阵激光应用的扩展，许多学者应用其治疗黄褐斑取得了良好的疗效。2005年Tannous报道应用1550nm点阵激光治疗多种治疗抵抗的混合型黄褐斑患者，治疗了2次，间隔3周，在随后的6个月随访中，见色素明显减退，而且无明显副作用。尔后，又不断有学者报道应用点阵激光治疗黄褐斑患者获得了较好的疗效。为进一步证实点阵激光的治疗效果，Goldberg等在治疗前及治疗后3个月取活检，光镜显示治疗后组织内色素细胞数量相对降低，电镜显示在角质形成细胞周围色素细胞数量减少及黑素颗粒相对减少，Goldberg认为可能与点阵激光改变组织的超微结构有关。其具体机制尚待研究。
激光治疗皮肤色素疾病时，高流量能直接汽化和剥脱病损组织，且治疗深度深，可能刺激皮肤色素细胞，导致明显的皮肤色素沉着反应，使色斑加深。激光在能量较低时有其光化学效应或生物学效应，对组织细胞产生一定影响。点阵激光以其特有的随机点状治疗模式，可以最大限度的减少激光光斑对周围组织热损伤，且治疗部位保留部分原有组织，“桥”状愈合模式缩短了治疗后恢复时间。有学者应用点阵激光高能量剥脱治疗黄褐斑后，其即时效果明显，但在治疗后3-6周，所有病例均出现暂时性炎症后色素沉着，同时部分病例伴发持久性红斑，提示点阵激光治疗黄褐斑的流量需要控制，避免出现明显剥脱效果。同时研究采用的为白色雌性小鼠，皮肤较人类薄，故本研究应用的点阵CO2激光流量为30mJ/c㎡，较低能量治疗，应用CPG（电脑图形生成系统）模式，点状散在治疗，中间保留部分原有组织，能有效缩短愈合时间。
笔者观察到点阵CO2激光治疗后皮损中c-kit表达明显降低，未干预组皮损中c-kit降低缓慢，两者相比有统计学意义；同时治疗后的黄褐斑模型比未治疗的色素减轻，提示点阵CO2激光在可能通过某一途径减少或抑制c-kit表达，达到治疗黄褐斑的目的，其具体机制仍须进一步研究。
