高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中的头孢尼西

周　昱，张　元，周一平，袁明美，冯雪松

(中国医科大学药学院，辽宁沈阳110013)



高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中的头孢尼西

周昱，张元，周一平，袁明美，冯雪松*

(中国医科大学药学院，辽宁沈阳110013)

摘要:建立了牛奶中头孢尼西的高效液相色谱串联质谱( HPLC-MS/MS)快速测定方法．样品采用乙腈提取，离心( 10 000 rmp，10 min)，上清液加入乙腈饱和的正己烷，振荡，取乙腈层，进行分析．采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱为分析柱，以5 mmol/L乙酸铵和乙腈为流动相，梯度洗脱分离，流速0．8 mL/min，温度35℃，进样量5 μL，采用电喷雾负离子模式进行电离，选择反应监测模式进行检测，外标法定量分析．头孢尼西在1．0～100 μg/L浓度范围内线性良好( r2=0．997)，检出限( LOD)为0．04 μg/L，定量限( LOQ)为0．15 μg/L，采用低、中、高3个添加水平，平行测定6次，所得平均回收率分别为90．3%、87．4%、93．5%，相对标准偏差( RSD)分别为4．5%、2．3%、2．1%．

关键词:牛奶;头孢尼西;高效液相色谱;质谱

β-内酰胺类抗生素是历史最悠久的抗微生物药物，同时也是使用量最大和最重要的一类抗生素［1］，主要用于抑制革兰氏菌［2］，如葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、大肠杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌等．β-内酰胺类抗生素作为奶牛饲养过程中经常使用的一类抗生素，其在牛奶中的残留将会对人体健康带来重要影响［3－5］．如引起过敏反应、造成泌尿系统损害和引起血液系统的反应，甚至偶尔引发肝炎［6］等．为了避免消费者受到食品中抗生素残留的危害，保护人民的身体健康，各国都对各种抗生素制定了严格的最高残留限量( MRL)［7］．如欧盟规定动物组织和牛奶中各类头孢菌素的MRL在20～100 μg/kg之间，其中牛奶中头孢喹诺的MRL为20 μg/kg，而头孢噻呋的MRL为100 μg/kg．头孢尼西作为第二代注射用广谱长效头孢菌素，其抗菌谱与头孢孟多类似，主要用于敏感菌所致的下呼吸道感染、尿路感染以及败血症等，残留在牛奶中的头孢尼西可造成消费者抽搐、头痛、精神紧张等健康问题．

目前，β-内酰胺类抗生素的检测方法主要有微生物法、免疫测定法、气相色谱法、液相色谱法以及液相色谱-质谱法等［8－15］．液相色谱-质谱法作为一种高灵敏度和高选择性的检测方法，其检出限越来越低，提供的碎片信息越来越多，在食品兽药残留中的应用也日趋广泛［16－17］．然而由于文献中所见报道的前处理繁琐，耗时较长，并且头孢尼西在常温条件下极不稳定．预实验证明头孢尼西钠1 000μg/L的标准品溶液在室温下放置一天将分解10%，因此关于头孢尼西的液相色谱-质谱检测方法尚未见报道．本研究采用乙腈提取牛奶中的头孢尼西，而后采用高效液相色谱串联质谱法建立了牛奶中头孢尼西含量的测定方法，该方法具有前处理简单、检出限低、灵敏度高、准确性好的优点，可用于日常食品样品中头孢尼西含量的测定．

1　实验部分

1．1仪器与试剂

液相色谱仪1260 (美国Agilent公司)串联API5500三重四极杆质谱仪(美国Applied Biosystem公司) ; Avanti J-30I离心机(美国Beckman Coulter公司) ; Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司) ; SA-31振荡器(日本Yamato公司) ;旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)．

头孢尼西钠(纯度≥99%)，购自德国Dr．Ehrenstorfer公司;乙腈、正己烷、乙酸铵为色谱纯，购自美国J＆K公司;实验用水由Millipore纯水仪制备．

1．2溶液配制

乙腈饱和正己烷:取100 mL正己烷和50 mL乙腈加入250 mL分液漏斗中，振摇1 min，静置分层后弃掉乙腈．

5 mmol/L乙酸铵:取385．4 mg乙酸铵加入1 L溶剂瓶内，去离子水定容．

1．3实验步骤

称取5 g试样(精确至0．01 g)置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，均质器均质2 min，提取液使用高速冷冻离心机在10℃，10 000 r/min离心10 min，然后加入10 mL乙腈饱和正己烷，震荡1 min，弃掉正己烷，过膜，上机．

1．4实验条件

液相色谱条件:色谱柱ZORBAX Eclipse XDBC18 column ( 150 mm×4．6 mm，5 μm) ;柱温35℃;样品室温度4℃;进样体积5 μL;流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈．梯度洗脱程序: 0～3．0 min，5%～50% B; 3．1～4．0 min，95% B; 4．1 ～5．0 min，5% B，流速为0．8 mL/min．

质谱条件:电喷雾电离源5 500℃，负离子模式，多反应监测( MRM) ;实验中所用的气体均为高纯氮气，碰撞气( CAD)压力为7 kPa，气帘气( CUR)压力为30 kPa，雾化气( GS1)压力为55 kPa，辅助气( GS2)压力为65 kPa．电喷雾电压( IS)为－4．5 kV，去溶剂温度( TEM)为600℃，碰撞室出口电压( CXP)为－21 V．分析物的定性/定量离子对，去簇电压( DP)及碰撞电压( CE)见表1．

表1　头孢尼西的质谱参数Table 1 Mass spectrometer parameters of Cefonicid

2　结果与讨论

2．1样品前处理条件的优化

多数乳制品样品中含有大量的蛋白质和脂肪，这会给后续的检测带来极大的干扰，所以在样品前处理中需要使用酸或有机溶剂将其中大部分的蛋白成分进行变性和沉淀．考虑到头孢尼西含有的四元环结构在强酸条件下不稳定，因此样品提取及沉淀蛋白应避免强酸的使用．本研究对比了有机溶剂甲醇和乙腈的提取效果，发现乙腈的提取效率优于甲醇的，结果见图1．乙腈提取物经过离心取上清液，用乙腈饱和的正己烷对上清液进行液液萃取，以有效去除牛奶中的脂肪．此方法离心后可以直接上机检测，不需采用SPE柱净化处理，大大缩短了前处理时间，并且节省了SPE柱耗材费用．

图1　不同试剂的提取效率对比Fig．1 Comparison of extract efficiency of different solvent

2．2色谱条件优化

液相色谱-质谱联用技术用于头孢尼西的检测尚未见报道，因此本研究考察了甲醇-水和乙腈-水作为流动相时检测头孢尼西的灵敏度(图2)．采用乙腈-水作为流动相，100 ppb头孢尼西的响应强度是甲醇-水作为流动相时的2倍，并且甲醇-水作为流动相的噪音较高，本研究选择乙腈-水为流动相．

图2　不同流动相头孢尼西标准溶液响应图Fig．2 Comparison of different mobile phase for cefonicid

2．3质谱条件的优化

在ESI+和ESI－离子化模式下，考察了头孢尼西的电离效果．实验表明，头孢尼西在ESI－电离方式下响应较好，这可能与头孢尼西呈弱酸性相关．头孢尼西的分子结构见图3．头孢尼西的定量离子对提取离子色谱图见图4．

图3　头孢尼西分子结构图Fig．3 Molecular structure of Cefonicid

图4　定量离子对提取离子色谱图Fig．4 Extracted ion chromatograph of Cefonicid

使用阴性牛奶提取液逐级稀释标准溶液至浓度为1、5、10、25、100 μg/L，在优化的色谱和质谱条件下测定，根据待测物浓度和定量离子峰面积关系进行线性回归．对阴性空白样品提取液进行加标实验，根据各定量离子3和10倍信噪比( S/N)对应样品中目标化合物的浓度，得到检出限和定量限(表2)．

表2　头孢尼西线性关系、检出限( LOD)和定量限( LOQ)Table 2 Quadratic relationships，limits of detection ( LOD) and limits of quantification ( LOQ) of Cefonicid

2．4回收率和精密度

在空白牛奶样品中添加3个浓度水平( 0．15、0．3、0．6 μg/L)的标准溶液，每个添加水平平行测定6次，测定结果见表3．实验结果表明，本方法的回收率在87．4%～93．5%范围内，精密度( RSD)小于5%，这表明本方法可以应用于实际样品的测定．

表3　头孢尼西平均回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of Cefonicid

2．5实际样品的测定

应用本方法对30份采集自超市的牛奶样品进行测定，均未检出头孢尼西．下一步将扩大样品范围、对集贸市场等地的样品也进行检测和分析，以摸清我国目前的牛奶中头孢尼西使用情况．

3　结论

通过对牛奶样品前处理方法的优化，建立了牛奶中头孢尼西的LC-MS/MS检测方法．该方法具有快速简便、准确度高、检出限低的特点，能够满足牛奶中头孢尼西的检测需求，其仪器条件也适用于其他类基质中头孢尼西的检测．

参考文献:

［1］刘荣森，赵文善．邻菲啰啉-Fe(Ⅱ)分光光度法测定头孢唑啉钠［J］．化学研究，2015，26( 1) : 54－57．

［2］中国兽药典委员会．中国兽药典［M］．北京:化学工业出版社，2005: 78－94．

［3］张琦，叶能胜，谷学新，等．β-内酰胺类抗生素分析检测技术及其应用研究进展［J］．化学通报，2009，72( 5) : 394 －400．

［4］孟静，王锐，祝建华．生鲜牛乳中抗生素检测方法的新问题［J］．中国乳品工业，2010，38( 9) : 42－44．

［5］VAN HOLTHOON F，MULDER P P，VAN BENNEKOM E O，et al．Quantitative analysis of penicillins in porcine tissues，milk and animal feed using derivatisation with piperidine and stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry ［J］．Anal Bioanal Chem，2010，396( 8) : 3027 －3040．

［6］CHIEN J Y，HSUEH P R，YU C J，et al．The evolution of drug-resistant microorganisms in patients with prolonged mechanical ventilation ［J］．Am J Infect Control，2010，37( 3) : 231－236．

［7］BOGIALLI S，CAPITOLINO V，CURINI R，et al．Simple and rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry confirmatory assay for determining amoxicillin and ampicillin in bovine tissues and milk ［J］．J Agric Food Chem，2004，52( 11) : 3286－3291．

［8］TSANG M W，SO P K，LIU S Y，et al．Catalytically impaired fluorescent class C β-lactamase enables rapid and sensitive cephalosporin detection by stabilizing fluorescence signals: implications for biosensor design ［J］．Biotechnol J，2015，10( 1) : 126－135．

［9］JUNZA A，DORIVAL-GARCÍA N，ZAFRA-GóMEZ A，et al．Multiclass method for the determination of quinolones and β-lactams，in raw cow milk using dispersive liquid-liquid microextraction and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．J Chromatogr A，2014，1356: 10－22．

［10］LIU X，YU Y，ZHAO M，et al．Solid phase extraction using magnetic core mesoporous shell microspheres with C18-modified interior pore-walls for residue analysis of cephalosporins in milk by LC-MS/MS ［J］．Food Chem，2014，150: 206－212．

［11］QUESADA-MOLINA C，GARCÍA-CAMPAÑA A M，DEL OLMO-IRUELA M．Ion-paired extraction of cephalosporins in acetone prior to their analysis by capillary liquid chromatography in environmental water and meat samples ［J］．Talanta，2013，115: 943－949．

［12］HOU X L，WU Y L，LV Y，et al．Development and validation of an ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determination of 10 cephalosporins and desacetylcefapirin in milk ［J］．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，931: 6－11．

［13］KARAGEORGOU E，MYRIDAKIS A，STEPHANOU E G，et al．Multiresidue LC-MS/MS analysis of cephalosporins and quinolones in milk following ultrasound-assisted matrix solidphase dispersive extraction combined with the quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe methodology［J］．J Sep Sci，2013，36( 12) : 2020－2027．

［14］CAPRIOTTI A L，CAVALIERE C，PIOVESANA S，et al．Multiclass screening method based on solvent extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of antimicrobials and mycotoxins in egg ［J ］．J Chromatogr A，2012，1268: 84－90．

［15］BERENDSEN B J，STOLKER L A，NIELEN M W．Assessment of liquid chromatography-tandem mass spectrometry approaches for the analysis of ceftiofur metabolites in poultry muscle ［J］．Food Addit Contam Part A，2012，29( 2) : 197 －207．

［16］BALIZA G，HEWITT A．Determination of veterinary drug residues by liquid chromatography and tandem mass spectrometry ［J］．Anal Chim Acta，2003，492: 105－131．

［17］钱永军，巩军，李云松．液相色谱-质谱联用检测乳中β-内酰胺类抗生素研究进展［J］．中国乳品工业，2005，33 ( 2) : 41－43．

［责任编辑:任铁钢］

Determination of cefonicid in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Yu，ZHANG Yuan，ZHOU Yiping，YUAN Mingmei，FENG Xuesong*

( School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110013，Liaoning，China)

Abstract:A method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( HPLC-MS) was established for the determination of cefonicid in milk．The milk sample was extracted with acetonitrile．Then，samples were centrifuged ( 10 000 r/min，10 min) to obtain the supernatant．After that the supernatant was added into acetonitrile-saturated hexane solutions and shaken to obtain the acetonitrile-soluble substances which were directly determined by HPLC-MS．The separation was performed on an ZORBAX Eclipse XDB-C18 column ( 150 mm×4．6 mm，5 μm) with 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile gradient solution as the mobile phase at a flow rate of 0．8 mL/min and 35℃．The sample injection volume was 5 μL．The electrospray source was operated in the negative ion mode，and monitored in the selective reaction monitoring ( SRM) mode．The concentration of cefonicid in the range of 1．0－100 μg/kg was linearly correlated to the peak area，with correlation coefficients 0．997．The limit of detection ( LOD) and limit of quantitation ( LOQ) were determined to be 0．04 μg/ L and 0．15 μg/L，respectively the recoveries of cefonicid were from 87．4% to 93．5% with the relative standard deviations ( RSD) of 2．1% to 4．5%( n = 6)．

Keywords:milk; cefonicid; high performance liquid chromatography; mass spectrometry

作者简介:周昱( 1989－)，女，硕士生，从事药剂学及药物分析研究．*通讯联系人，E-mail: voncedar@ 126．com．

基金项目:辽宁省科学技术厅自然科学基金( 201202252)．

收稿日期:2015－11－09．

中图分类号:R917

文献标志码:A

文章编号:1008－1011( 2016) 01－0077－04