白芍提取物对PMS肝气郁证大鼠下丘脑Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ/BDNF信号通路的影响＊

宋春红，王杰琼，李 芳，李自发，魏 盛，王美艳，薛 玲＊＊，姜运良

（1.山东农业大学动物科技学院 泰安 271018；2.山东中医药大学实验动物中心 济南 250355；3.山东中医药大学药学院 济南 250355；4.北京市丰台区妇幼保健院 北京 100067）

白芍提取物对PMS肝气郁证大鼠下丘脑Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ/BDNF信号通路的影响＊

宋春红1，2，王杰琼3，李 芳4，李自发2，魏 盛2，王美艳3，薛 玲3＊＊，姜运良1＊＊

（1.山东农业大学动物科技学院 泰安 271018；2.山东中医药大学实验动物中心 济南 250355；3.山东中医药大学药学院 济南 250355；4.北京市丰台区妇幼保健院 北京 100067）

目的：本文主要探讨白芍提取物对PMS肝气郁证大鼠下丘脑Cav1.2钙通道关键蛋白CACNA1C及其下游信号通路中CaM、BDNF蛋白表达和对CaMKⅡ磷酸化的影响，从而明确白芍提取物治疗肝气郁结证的分子作用靶点。方法：利用慢性束缚应激法制备PMS肝气郁证大鼠模型，使用白芍提取物进行药物干预。模型制备成功后检测下丘脑CACNA1C蛋白表达，以及下游信号通路中CaM、BDNF蛋白表达和CaMKⅡ的磷酸化水平。离体培养海马原代神经元，通过KCl激活L型钙通道，检测白芍提取物中的有效成分单体芍药苷对细胞内钙超载的影响。结果：PMS肝气郁证大鼠下丘脑CACNA1C蛋白表达增加，CaMKⅡ磷酸化水平提高，BDNF表达减少，说明白芍提取物可显著改善上述蛋白表达异常的现象，抑制KCl激活的L型钙通道引起的细胞内钙离子浓度的增加。结论：白芍提取物可能是通过调控细胞内Cav1.2，抑制其下游CaM/CaMKⅡ信号通路的活化发挥治疗PMS肝气郁证的作用。

PMS肝气郁证 白芍提取物 L型钙通道α1C亚基基因 钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ 脑源性神经营养因子

白芍能养肝血，补肝阴，抑肝阳，为促进肝主疏泄调畅情志活动的重要中药之一。在现代中医药研究中，常用白芍治疗抑郁。白芍提取物是从中提取的，经过精制、浓缩、干燥而成的天然提取物。课题组前期研究表明白芍提取物对PMS肝气郁证模型大鼠有治疗作用[1]。CACNA1C基因编码L型钙通道（Cav）的α1C亚基，该亚基是构成功能性钙通道的主要成分，近年来研究表明CACNA1C基因多态性与情绪类疾病如精神分裂症和重度抑郁发生有关，且与女性的发病更为密切[2]。研究者们认为PMS的发生过程中易感的神经生物学因子与重度抑郁症相似[3]。本课题组前期研究表明PMS肝气郁证大鼠L型钙通道功能改变。那么白芍提取物治疗PMS肝气郁证与Cav1.2通道及其下游信号通路关系如何？本研究利用慢性束缚应激方法制备PMS肝气郁证大鼠模型。在整体动物水平检测白芍提取物对PMS肝气郁证大鼠下丘脑中CACNA1C蛋白的表达及其介导的CaM/ CaMKII信号的影响。在离体细胞水平，检测芍药苷对L型钙通道（Cav）激活后细胞内钙离子的动态变化影响。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康雌性Wistar大鼠140-160 g，30只，由山东中医药大学实验动物中心提供[生产许可证号SCXK（鲁）2011-0003]。大鼠购买后饲养于行为学实验室一周，置于20±2℃昼夜颠倒的环境，每日21∶00开灯、9∶00关灯。除实验期外自由饮食饮水。各组大鼠每日均由实验操作者抓握移动，熟悉环境从而消除人为操作的影响。

1.2 实验药品与试剂

白芍提取物（青岛阳光海川医药科技发展有限公司，批号：20110527）；CACNA1C鼠单克隆一抗（英国Abcam公司，货号：ab58552）；CaM一抗（美国Sigma公司，货号：SAB4503194）；CaM-PK II兔多克隆一抗（美国Cell Signaling Technology公司，批号：4436）；p-CaMKII（Thr286）兔多克隆一抗（美国Cell Signaling Technology公司，批号：3361）；BDNF兔单克隆一抗（美国Sigma公司，货号：AV41970鼠单克隆一抗）；Tubulin兔单克隆一抗（美国Abmart公司，货号：M2005）。山羊抗兔二抗（济南远达晶美生物科技有限公司，货号：SB20026619）；蛋白Marker（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：SM0671，批号：26681），预染蛋白marker（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：26619）；蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司，货号：P8340）。Fluo-4（美国Life Technologies公司，货号：F1420126619），Neurobasal培养基（美国Gibco公司，货号：21103，批号：10888-022），B-27@ Supplement（50×）（美国Gibco公司，货号：17504-044）。

1.3 实验仪器

显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：CX21）；大鼠旷场实验箱（北京天鸣宏远科技发展有限公司，型号：XR-XZ301）；SDS-PAGE电泳仪、蛋白印迹转移装置（美国伯乐公司，型号：041BR86548）；凝胶成像系统（英国Syngene公司，型号：G：BOX Chemi XR5）。激光共聚焦显微镜（日本ZEISS公司，型号：LSM510）。

2 方法

2.1 PMS肝气郁证大鼠模型制备、给药及行为学评价

选用慢性束缚应激法制备模型[4]。采用旷场实验筛选得分相近大鼠进入实验，依阴道涂片镜检法确定大鼠的动情周期。根据阴道涂片结果，选择动情周期处于非接受期（动情间期和动情后期）大鼠30只，标记，称重。按随机数字表的方法将大鼠随机分为3组,分别为正常对照组（简称正常组）、PMS肝气郁证模型组（简称模型组）、PMS肝气郁证造模给予白芍提取物组（简称白芍组）。白芍组在造模的同时每天上午9∶00灌胃给药一次，每日给药剂量为36 mg·kg-1（相当于人临床8倍剂量），持续造模过程整个阶段。正常组和模型组大鼠给予相同体积的灭菌饮用水。造模完成后，即进行旷场实验，计算糖水消耗量以及强迫游泳实验。

2.1.1 旷场实验

给药结束后，应用XR-XZ301旷场实验系统，XR-SuPerMaze动物行为视频跟踪分析系统，进行旷场实验。旷场箱尺寸L×W×H=100 cm×100 cm ×50 cm（大鼠），摄像采样速度：15 帧/秒；每只大鼠观察时间为6 min，每只大鼠实验结束后使用酒精清洁旷场箱。

2.1.2 强迫游泳实验

将大鼠放入水温23℃、水深30 cm的透明玻璃桶中（高度：40 cm，直径：20 cm），同时进行视频采集，15 min后，将实验动物转移至干燥环境30 min，待大鼠毛发干燥后将其移回鼠笼中，每只大鼠实验结束后清洁圆筒并换水。实验结束后使用视频分析软件进行视频分析，记录悬浮不动时间、悬浮不动次数和潜伏期，其中悬浮不动为大鼠身体漂浮于水面身体轻微运动保持鼻孔露出水面。

进行强迫游泳的同时应用Smart 3.0行为学视频采集与分析系统采集大鼠行为学数据（悬浮不动时间、悬浮不动次数），并通过后期观看录像记录大鼠强迫游泳潜伏期。

2.2 脑组织取材

强迫游泳实验完毕后，将大鼠称重，断头处死，于冰上迅速剥离下丘脑装入1.5 mL离心管中，立即置于液氮罐中迅速冷冻，后转移入-70℃冰箱备用。

2.3 样品蛋白浓度检测

取出脑组织，室温解冻，配裂解液（PMSF：RIPA =1：100），称量组织重量，按照组织重量（mg）：裂解液体积（μL）=1：7.5比例加入裂解液，用组织匀浆器研磨组织至无组织块。4℃ 13 000 rpm离心10 min，取上清液。按照蛋白上清液体积：5×Loading Buffer体积=1：4比例加入5×Loading Buffer，混匀后100℃水浴变性5-10 min，-20℃保存。按照BCA试剂盒说明书操作计算蛋白浓度。

2.4 Western bolt法测定下丘脑中相关蛋白的表达

以40 μg下丘脑总蛋白每泳道上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿法转移至NC膜上，将NC膜室温震荡2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。分别于相应的一抗（Anti-CACNA1C， 1：500；Anti-CaM，1：800；Anti-CaMKⅡ，1：1 000； Anti-p-CaMKⅡ，1：1 000；Anti-BDNF，1：1 000；Anti-Tubulin，1：2 000）摇床4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室温振摇。将NC膜放入二抗稀释液中室温振摇1 h。TBST洗膜3次，室温振摇10 min最后用TBS洗膜1次，室温振摇10 min。ECL发光液A液和B液等体积避光混匀，配成发光液。吸去NC膜表面的TBS，在目的条带附近滴加发光液，最后使用成像仪成像。

2.5 芍药苷对L型钙通道激活后细胞内钙离子浓度的影响

参照课题组之前的SOP体外培养大鼠海马原代神经元[5]，在培养至第7天加入芍药苷，干预时间为24 h，细胞分组情况如下：空白组、芍药苷高剂量组（200 μM）、芍药苷中剂量组（100 μM）、芍药苷低剂量组（50 μM）。用HBSS清洗细胞3次，加入Fluo-4染料1 mL，37℃，孵育45 min。洗净Fluo-4染料，并使用HBSS将细胞外残留的染料洗净，再加入1 mL HBSS，孵育15 min，使细胞内钙离子与染料充分结合。

图1 各组大鼠旷场试验得分以及糖水偏好率统计结果

利用GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析，数据以±s表示，采用one-way ANOVA进行分析，P＜0.05认为差异有统计意义。

3 结果

3.1 PMS肝气郁证大鼠模型评价

3.1.1 各组大鼠的宏观行为学表现

实验前，各组大鼠均精神状态良好活泼好动、毛有光泽、眼角干净、球形粪便。第一天束缚时，模型组和给药组大鼠表现为强烈的反抗、嘶叫、双目圆睁、毛须竖立、粪便明显增多；造模结束后，对照组大鼠的状态与初期相同，模型组大鼠不活跃，精神萎靡，毛发散乱直立、眼神呆滞，大便变稀，反抗能力明显降低；解开束缚纱布时，未见对峙，大多跑到角落不动。而给药组大鼠在被抓时，叫声较柔和，毛发较整洁，眼角干净，与模型组相比活动明显较多。

3.1.2 旷场试验得分以及糖水偏好率

旷场试验得分是动物探索行为及兴奋性的总体反应，本实验结果如下图1所示，造模前各组大鼠旷场试验得分无显著性差别；造模后，与正常组相比，模型组大鼠旷场实验得分显著性降低（P＜0.01）；白芍组无显著性差异。造模前各组大鼠糖水消耗量无显著性差别，造模后，与正常组相比，模型组大鼠糖水偏好率呈极显著性降低（P＜0.001），白芍组大鼠无显著性差别。

3.1.3 强迫游泳实验

给药后，大鼠非接受期悬浮不动时间结果显示，与对照组相比，模型组显著性升高（P＜0.05）；与模型组相比，白芍组显著性降低（P＜0.01）。大鼠悬浮不动次数结果显示，与对照组相比，模型组显著性升高（P＜0.01）；与模型组相比，白芍组显著降低（P＜0.01）。如图2所示。

曝光时间100 ms，荧光参数为：激发波长488 nm，发射波长530 nm。每3 s收集一次图片，采集240 s，第30 s向细胞中加入KCl，使其终浓度为100 mM。

2.6 数据分析

3.2 各组大鼠下丘脑Cav1.2介导的CaMKⅡ信号通路关键蛋白表达与磷酸化水平

本实验研究每组样本量为6，主要观察CaMKⅡ蛋白表达量及其磷酸化水平，详见图2、图3。与正常组相比，模型组大鼠下丘脑中CACNA1C蛋白表达量显著增加（P＜0.01），BDNF蛋白表达量显著降低（P＜0.05），CaMKⅡ蛋白的磷酸化水平显著增加（P＜0.01），白芍组CaM蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，白芍组大鼠下丘脑中CACNA1C蛋白表达量显著降低（P＜0.01），CaM蛋白表达量显著降低（P＜0.01），BDNF蛋白表达量显著增高（P＜0.01），CaMKⅡ蛋白的磷酸化水平显著降低（P＜0.01）。

3.3 芍药苷对海马神经元内钙离子浓度变化

实验结果显示，加入KCl后细胞内荧光强度增加，如图5、6所示。与对照组相比，芍药苷各剂量组荧光强度显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且降低程度与剂量相关。

4 讨论

本文从体内外两个水平研究了白芍提取物及其主要有效单体芍药苷对PMS肝气郁证大鼠脑中L型钙通道（Cav1.2）介导的CaM/CaMKⅡ信号通路的作用。实验结果表明Cav1.2介导的CaM/ CaMKⅡ在模型组大鼠中关键蛋白CACNA1C的蛋白表达和CaMKⅡ的磷酸化水平是升高的而BNDF蛋白表达降低；造模同时给予白芍提取物后大鼠下丘脑中上述蛋白无异常表达的现象。高浓度KCL在细胞内可激活L型钙通道，芍药苷可显著抑制由KCL引起的细胞内钙超载。

图2 给药后各组悬浮不动时间、次数比较

图3 各组大鼠下丘脑CACNA1C及相关蛋白的Western Blot电泳图

图4 各组大鼠下丘脑CACNA1C及相关蛋白的相对表达量

图5 加KCl前后细胞内荧光强度变化

图6 添加KCL后细胞内钙离子浓度的变化

近年的研究认为CACNA1C是精神情感障碍类疾病的易感基因之一[6]，基因敲除实验表明经基因修饰的CACNA1C-/-小鼠对二氢吡啶不敏感，硝苯地平对强迫游泳实验的小鼠无抗抑郁作用，说明CACNA1C介导了LTCC拮抗剂的抗抑郁效果[7]。CACNA1C杂合基因敲除的小鼠可以改变抑郁症状的表型，同时L型钙通道1.2亚型（Cav1.2）通道蛋白表达水平降低和LTCC通道电流减少。在临床上L型钙通道拮抗剂尼莫地平已经应用于情感障碍类疾病的治疗[8]。本实验发现在模型组下丘脑中CACNA1C蛋白表达升高，该蛋白的高表达可能就增加了LTCC的电流密度，因此使得细胞内钙离子浓度增加，钙离子与CaM结合后激活了CaMKⅡ，这与本实验结果p-CaMKⅡ水平升高是一致的。CaMKⅡ磷酸化后作用的靶蛋白之一即是CREB，p-CaMKⅡ可使CREB的两个位点发生磷酸化，这两个位点分别是Ser133和Ser142，Ser133和Ser142位点的磷酸化分别能启动和抑制相关基因的转录。研究认为CaMKⅡ主要是对Ser142发挥作用。本实验没有购买到检测Ser142位点磷酸化的CREB抗体，所以本文直接检测了CREB调控的BDNF蛋白的表达。结果显示模型组BDNF表达降低，而白芍组表达升高。这说明CaMKⅡ磷酸化后可能通过对CREB Ser142位点的磷酸化抑制了BDNF的表达。因此结合本实验认为下丘脑中CACNA1C高表达导致的细胞内CaM/ CaMKⅡ的激活与PMS肝气郁证的发生有关。

白芍提取物中主要药效成分芍药苷具有促进皮层神经元生长，保护脑缺血后损伤的作用，可以改善神经行为学症状，血脑屏障通透性，增加大脑局部血流量以及抗抑郁等作用[9]。而且研究结果也表明芍药苷对神经系统的保护作用与抑制细胞内钙超载密不可分[10]。Wang等[11]发现芍药苷能通过抑制PC12细胞内CaM/ CaMKⅡ来发挥其神经保护的作用。结合本实验结果，本文推测白芍提取物可能通过抑制Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路来发挥其治疗PMS肝气郁证的作用。

为验证白芍提取物是否特异性作用于L型钙通道，本研究使用L型钙通道激活剂KCL激活海马原代神经元，利用荧光标记结合激光共聚焦显微镜动态检测细胞内钙离子的荧光强度变化。实验选择的是海马原代神经元细胞而没有选择下丘脑神经元细胞，主要原因如下：第一，海马是神经元原代培养的首选部位，该脑区所含神经元密度高，非神经元细胞相对较少，培养方法成熟；第二，24h内新生鼠下丘脑体积非常小，从实验动物福利角度选择体积大的海马脑区；第三，本文体内实验结果初步判断白芍提取物可能会作用到L型钙通道，在体外细胞的验证中只要神经元上表达L型钙通道，实验结果就能证实其特异性作用。

本研究体内体外两个层次验证了白芍提取物对Cav1.2钙通道的抑制作用，为该药物在治疗精神情感障碍类等情绪类疾病的应用提供理论基础。

1 李芳,宋春红,魏盛,等.白芍提取物对经前期综合征肝气郁证模型大鼠额叶5-HT（3A/3B）R分布与蛋白表达的影响.世界科学技术-中医药现代化,2015,17(11):2267-2271.

2 Bigos K L, Mattay V S, Callicott J H, et al. Genetic variation in CACNA1C affects brain circuitries related to mental illness. Arch Gen Psychiatry, 2010, 67(9): 939-945.

3 Gingnell M, Comasco E, Oreland L, et al. Neuroticism-related personality traits are related to symptom severity in patients with premenstrual dysphoric disorder and to the serotonin transporter genelinked polymorphism 5-HTTPLPR. Arch Womens Ment Health, 2010, 13(5): 417-423.

4 魏盛,王海苹,乔明琦.慢性束缚应激及居住入侵法制备经前期综合征肝气郁证大鼠模型的行为学观测与分析.世界科学技术-中医药现代化,2012,14(4):1848-1852.

5 李芳,乔明琦,葛庆芳,等.舒郁胶囊对大鼠海马原代培养神经元Ca2＋-CaM通路的作用.中国药理学通报,2012,12:1762-1765.

6 Erk S, Meyerlindenberg A, Linden D E, et al. Replication of brain function effects of a genome-wide supported psychiatric risk variant in the CACNA1C gene and new multi-locus effects. Neuro Image, 2014, 94, 147-154.

7 Dao D T, Mahon P B, Cai X, et al. Mood disorder susceptibility gene CACNA1C modifies mood-related behaviors in mice and interacts with sex to influence behavior in mice and diagnosis in humans. Biol Psychiatry, 2010, 68(9): 801-810.

8 Wisner K L, Peindl K S, Perel J M, et al. Verapamil treatment for women with bipolar disorder. Biol Psychiatry, 2002, 51(9): 745-752.

9 Qiu F, Zhong X, Mao Q, et al. The antidepressant-like effects of paeoniflorin in mouse models. Exp Ther Med, 2013, 5(4): 1113-1116.

10 Wang D, Wong H K, Feng Y, et al. Paeoniflorin, a natural neuroprotective agent, modulates multiple anti-apoptotic and proapoptotic pathways in differentiated PC12 cells. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(4): 521-529.

11 Wang D, Tan Q, Zhang Z. Neuroprotective effects of paeoniflorin, but not the isomer albiflorin, are associated with the suppression of intracellular calcium and calcium / calmodulin protein kinase II in PC12 cells. J Mol Neurosci, 2013, 51(2): 581-590.

Extracts of Radix Paeoniae Alba Affects the Hypothalamic Cav1.2 Regulated by the CaM / CaMKII / BDNF Signaling in Premenstrual Syndrome (PMS) Rats with Liver-Qi Depression

Song Chunhong1,2, Wang Jieqiong3, Li Fang4, Li Zifa2, Wei Sheng2, Wang Meiyan, Xue Ling3, Jiang Yunliang1
(1. College of Animal Sciences, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China;
2. Laboratory Animal Center , Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
3. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
4. Department of Pharmacy, Fengtai Maternal & Children's Health Hospital of Beijing, Beijing 100069, China)

This study aimed to explore the impacts of the extracts from Radix Paeoniae Alba on hypothalamic CACNA1C, the key protein of Cav1.2 channel, and hypothalamic CaM and BDNF in its downstream, as well as the phosphorylation of CaMKⅡ in the hypothalamus in PMS rats with liver-qi depression. On this basis, the molecular targets of the extracts engaged in the treatment was confirmed. The PMS model rats with liver-qi depression were caused by chronic restraint stress taking the extracts from Radix Paeoniae Alba as its treatment. When verified success of the modeling of liver-qi depression, the hypothalamic protein expressions of CACNA1C, CaM and BDNF of its downstream and the phosphorylation of CaMKⅡ were detected. Then the hippocampal primary neurons were cultivated in vitro, in which the L-type calcium channels was activated by KCl to test the effects of paeoniflorin monomer, one of the active ingredients in the extracts, on intercellular calcium overload in the hippocampal neurons. In the experiment, it was found that the protein expressions of hypothalamus CACNA1C and p-CaMK II increased, while hypothalamus BDNF decreased significantly, which indicated that the extract of Radix Paeoniae Alba could regulate the abnormal expressions of the aforementioned proteins and inhibit the augmented intercellular calcium concentration caused by the activation the L-type calcium channels stimulated by KCl. In conclusion, it was demonstrated that the extract of Radix Paeoniae Alba could suppress the activation of CaM / CaMKⅡ signaling in its downstream by the regulation of intercellular Cav1.2 channels to achieve the efficacy of mitigating PMS liver-qi depression in rats.

Premenstrual syndrome model rat with liver-qi depression, the extracts of Radix Paeoniae Alba, L-type calcium channel α1 C subunit, calmodulin dependent protein kinase II, brain-derived neurotrophic factor

10.11842/wst.2016.10.021

R285.5

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-05-22

修回日期：2016-06-12

＊ 国家自然科学基金委青年科学基金项目（81473359）：Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ钙信号通路在PMS肝气郁证中的作用及舒郁胶囊干预机制研究，负责人：宋春红；山东省卫生厅中医药科技发展计划项目任务书（2013-025）：舒郁胶囊对抑郁症模型大鼠海马脑区钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（ CaMKII）表达和分布的影响，负责人：宋春红。

＊＊ 通讯作者：薛玲，教授，主要研究方向：中药药理学；姜运良，教授，主要研究方向：动物分子遗传学。