低强度超声促进周围神经修复的研究进展

蒋文莉 ，唐　杰 ，王月香

(1.解放军总医院超声科，北京　100853；2.北京医院超声科，北京　100730)



低强度超声促进周围神经修复的研究进展

蒋文莉1,2，唐杰1，王月香1

(1.解放军总医院超声科，北京100853；2.北京医院超声科，北京100730)

摘要：周围神经损伤后的修复一直是医学界研究的热点和难点。虽然显微外科学的发展以及组织工程的出现，为周围神经损伤后的修复带来了佳音，但是目前其临床疗效仍不十分理想。低强度超声波作为物理治疗的一种方式，被研究认为能促进周围神经损伤的修复。低强度超声主要利用超声波的机械效应，提高细胞膜和细胞壁的通透性，增强细胞的新陈代谢，促进细胞生长。低强度超声治疗最早在临床上主要应用于促进骨折愈合、肌腱愈合及软骨、椎间盘等组织的愈合中。早期人们也研究过低强度超声在神经系统中的作用，争论的焦点主要在连续超声或脉冲超声方式的选择以及热效应是否发挥作用上。初步研究表明：低强度超声可以促进雪旺细胞增生以及在大鼠坐骨神经挤压伤、坐骨神经截断伤、神经导管修复缺损坐骨神经等神经损伤过程中的修复和再生。对于其作用的机制的研究也从细胞学、分子生物学、酶学、离子通道等多个角度进行了探索。作为无创便捷的治疗方法，低强度超声虽然还有很多方面的问题尚待商榷研究，其未来广阔的临床应用空间是值得肯定和期待的。

关键词：周围神经损伤；再生和修复；低强度超声

当今社会由于自然灾害、交通事故、战争及意外创伤等造成的周围神经损伤的发生率相当可观，在欧洲每年有30万的周围神经损伤病例[1]。周围神经损伤后的修复一直是医学界研究的热点和难点。1997年Terzis等[2]提出了自体神经移植术，自此自体神经移植一直被认为是周围神经损伤后治疗的“金标准”，自体移植后周围神经缺损病例临床功能恢复率达80%[3]。但是由于供体神经来源有限，需要二次手术及供体部位功能缺失、易发并发症等原因，自体神经移植的发展受到了限制。虽然近年来组织工程的发展为周围神经缺损的修复提供了新的材料和思路，但是显微外科手术后神经功能的恢复时间仍很长，且效果并不十分理想。进一步研究促进轴突再生的技术方法，将有助于推进周围神经损伤后修复的研究进展，具有重要的临床意义。近年来许多物理治疗方法，如激光、电刺激、磁场及超声波等被应用到促进周围神经损伤后的修复和再生中来，并证实确实有效[4]。

1低强度超声波的物理作用机制

超声波是物体的机械振动在介质中传播时形成的机械振动波，能进入和穿过生物组织，以其特有的机械效应、热效应及空化效应，正广泛应用于临床诊断和治疗的各个方面。

当超声波进入人体组织后，组织将会吸收一定数量的声波，使组织温度升高。温度升高的幅度与声波的强度及照射时间等都有直接的关系。这就是超声波的热效应。机械效应是超声波最基本的作用。超声波是一种机械振动波，当声强较低时，生物组织在超声波作用下能产生弹性振动，其振幅和超声波声强的平方根成正比，当声强较高时，组织的振动会超过其弹性极限，造成组织断裂或者破坏。超声手术刀和超声碎石等都是利用这一效应进行工作。在组织中会存在一些小气泡，在超声的作用下，小气泡的振动会增强，甚至破裂，伴随局部的高温、高压，从而引起生物学反应。这就是超声的空化效应。在超声治疗过程中，主要利用上述几种效应通过超声能量的变化来促进生物组织反应，达到治疗目的。目前临床上超声治疗的应用主要有如下一些方面：超声碎石、超声理疗、超声手术刀、高强度超声聚焦治疗、超声美容、超声白内障乳化、超声药物透入疗法、超声雾化吸入疗法、超声洁牙等。超声剂量学的产生让超声治疗应用中的剂量选择有了更多的研究依据。不同频率不同剂量的超声照射可能会带来不同的生物学效应。在一定范围内，超声治疗引起的生物效应是安全的有效的。一旦超过安全阈值，可能会带来不可逆的生物学破坏。

而小于3 W·cm-2的低强度脉冲超声,主要利用超声波的机械效应来对病变进行治疗。低强度脉冲超声能增强细胞膜、细胞壁附近或细胞液内液态介质点的运动，从而增强细胞膜及细胞壁的能量传递，加速反应底物与催化酶的作用及作用产物的释放，提高生物反应的速度。另外低强度脉冲超声在传播过程中能产生有规律的稳态空化效应，空化泡的振动能对其他微粒产生剪切作用。低强度脉冲超声主要是依靠这种机械振动及稳态空化效应，使胞内质流动，并且提高细胞膜及细胞壁的通透性，从而促进细胞新陈代谢[5]。

2低强度超声在促进骨折愈合、肌腱愈合等其他领域的研究现状

低强度脉冲超声被证实对很多组织损伤有治疗修复作用。1983年Duarte[6]首先将强度分别为49.6 mW·cm-2和57 mW·cm-2脉冲重复频率为1 MHz的低强度超声应用到假性关节和骨折的治疗中。大量临床研究亦证实了低强度脉冲超声对新鲜骨折和骨不连的促进作用。对于术后延迟愈合和骨不连患者，低强度超声辐照可作为首选治疗方法，在术后6个月内治疗可取得较好疗效。随着低强度脉冲超声波对骨折和骨不连治疗效果的深入而广泛的研究，此项技术在运动医学和骨科康复领域逐渐进入临床。

美国食品药品监督管理局分别于1994年10月和2000年2月相继批准低强度脉冲超声能促进新鲜骨折的愈合及治疗陈旧性骨不连[7]。许多学者也证实强度小于等于100 mW·cm-2的低强度脉冲超声能影响许多生物过程，比如：患有糖尿病大鼠的皮肤愈合,慢性静脉曲张溃疡的修复,慢性炎症过程,成骨不全的康复[8]等。低强度超声还能增强各种软组织的愈合，比如软骨、椎间盘等。它还能通过影响软骨组织而影响骨—肌腱连接处，从而促进肌腱的愈合[9]。

3低强度超声在神经系统的研究状况

在超声生物效应研究的早期阶段，人们就开始关注超声对神经系统的作用。1929年Harvey等报道神经肌肉准备好的青蛙坐骨神经受到超声刺激时，其腓肠肌发生摆动，而用箭毒处理的肌肉却不能摆动。1939年Pohlman团队第一次报道超声能成功治疗坐骨神经和臂丛神经功能紊乱。1942年和1952年Scholtz和Stuhilfuth分别证实超声在神经组织的临床疗效中发挥重要作用[10]。1988年Hong等[11]首次观察了强度0.5 W·cm-2，频率1.0 MHz连续脉冲超声对损伤神经再生的加速作用。从此很多动物实验及临床研究用来研究其作用机制。但是这些研究大多集中在对连续性脉冲超声上，机制研究也主要在争论是热效应还是非热效应。目前强度在0.05～0.5 W·cm-2之间的超声被广泛应用于影像方面。

4低强度超声在周围神经损伤后修复中的研究现状

4.1低强度超声对周围神经损伤后的修复的作用

4.1.1低强度脉冲超声对离体雪旺细胞的作用雪旺细胞是周围神经系统中重要的胶质细胞,是周围神经微环境中促进轴突再生的最关键因素，对神经的再生和成熟起着至关重要的作用，主要表现为：分泌多种神经营养生长因子且均能显著地促进神经轴突的生长；表达细胞黏附分子，如层黏连蛋白、纤黏连蛋白、神经细胞黏附分子等；清除远端残干处轴突残片，形成神经内膜鞘层，从而支持和引导轴突生长等。研究表明，低强度超声可促进雪旺细胞增生、防止细胞死亡，从而促进神经恢复，并可促进雪旺细胞NT-3基因的表达[12-15]。

4.1.2低强度超声对大鼠坐骨神经挤压伤的作用坐骨神经挤压伤后，应用低强度超声对神经损伤部位进行辐照后，在超声辐照后不同时间段(2、4、6、8周)治疗组坐骨神经功能指数、感觉神经传导速度、神经生长因子及有髓鞘神经纤维密度、髓鞘厚度等均显著高于对照组。研究认为损伤后早期应用低强度脉冲超声可促进受损神经的恢复，而神经生长因子上调可能是低强度超声促进损伤神经修复的作用机制[16]。

4.1.3低强度超声对坐骨神经截断伤的作用研究显示坐骨神经截断伤后局部应用低强度超声可显著促进损伤处神经组织的增生[8]。

4.1.4低强度超声对大鼠神经导管修复神经的作用研究显示，经过超声辐照作用的porous PLGA/Pluronic F127神经导管内轴突的生长速度(每天0.71 mm)显著高于未经超声辐照的神经导管内轴突生长速度(每天0.48 mm)，且治疗组的轴突面积、直径和髓鞘厚度均显著高于对照组，提示低强度超声对神经导管内的轴突再生起到良好的促进作用[13]。

4.2不同强度不同频率的低强度脉冲超声对周围神经损伤的修复作用 尽管有很多研究证实低强度脉冲超声能加速周围神经的修复，但是各家所用的强度与频率却并不一致。Mourad等[16]应用强度0.25 W·cm-2，频率2.25 MHz的低强度脉冲超声，在术后第3天开始治疗大鼠坐骨神经挤压伤，每周3次，共60 s。治疗14 d后足部功能试验证实治疗组与对照组坐骨神经功能改善状况有统计学意义。Crisci等[8]应用强度16 mW·cm-2，频率1.5 MHz的脉冲超声治疗神经离断术后24 h的大鼠，每天20 min，连续12 d，然后证实大鼠坐骨神经功能明显改善。Chang等[12]分别应用强度0.3 W·cm-2，频率1.5 MHz以及强度为0.2 W·cm-2，频率1 MHz的低强度超声治疗离体雪旺细胞及神经导管修复的神经缺损处，每天5 min，连续2周后证实雪旺细胞增殖分化增强而坐骨神经功能改善。

4.3低强度脉冲超声促进周围神经损伤修复可能的机制虽然对于低强度脉冲超声促进周围神经损伤修复的机制目前尚不完全清楚，但是学者们已经从细胞学、分子生物学、酶学、离子通道等多个角度对此进行了探索。

Zhang等[14]利用1 MHz，100 mW·cm-2的低强度脉冲超声照射雪旺细胞，每天5 min，研究结果显示低强度脉冲超声能促进雪旺细胞标记物S-100的增殖分化，而且能通过提高NT-3和BDNF的mRNA的表达来促进雪旺细胞增殖。Tsuang等[15]研究推测：低强度超声能影响细胞膜Ca2+-ATP酶、H+-ATP酶和其他离子通道的活性，这些对细胞的存活和增殖都非常重要。低强度超声能增强酶的活性，增加细胞膜的通透性和选择性，增强细胞膜的流动性，从而加快细胞代谢。但是同时他们也观察到过长时间或者过大强度的超声照射却适得其反，能破坏细胞膜的结构，使很多酶失活，细胞代谢破坏，导致很低的细胞存活率和增殖率。低强度脉冲超声的这个作用他们实验损坏较严重的组中出现得更早。从而进一步研究得出结论：低强度脉冲超声能在24 h内上调IL-6基因的表达而在48 h内下调IL-6的表达，8 h内下调IL-1和TNF-α基因表达并下调P0，48 h内上调IL-1基因表达。Raso等[4]研究后认为低强度超声促进神经再生可能的机制包括：热效应能促进血管扩张，增加新生血管的形成，增加局部营养；神经发芽刺激神经纤维密度增加；激活雪旺细胞恢复神经管；化学因子或调解因子的释放能刺激轴突的生成。Kusuyama等[17]通过对多分化潜能的间充质干细胞及祖细胞系的研究发现低强度脉冲超声能通过抑制PRARγ2通过ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK通道，从而抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化而促进间充质干细胞向成骨细胞分化。Lv等[18]研究证实：低强度脉冲超声能促进iPSCs源性神经嵴干细胞的增殖分化。

4.4低强度脉冲超声促进周围神经损伤修复的主要研究方式 外周神经损伤后的再生包括两个部分的变化：一部分是损伤侧近端神经的生长锥类似结构的形成，另一部分是损伤侧远端Wallerian变性过程中雪旺细胞增殖诱导作用[19]。目前对于低强度脉冲超声促进周围神经再生的研究主要包括体外细胞培养和体内动物实验两大部分。

(1)体外实验主要是以神经胶质细胞—雪旺细胞和多分化潜能间充质干细胞的培养研究为主，通过细胞生物学技术、分子生物学技术等从形态上、数量上及基因表达方式等方面，评估低强度脉冲超声治疗后细胞的增殖分化状况，并初步探讨其作用机制。

(2)体内实验主要以大鼠或新西兰兔的坐骨神经、腓神经、动眼神经[20]病变模型为主。所应用的动物模型包括：坐骨神经挤压伤模型、周围神经缺损模型、神经导管修复缺损周围神经模型等，坐骨神经自体神经翻转移植模型通常是作为对照组来研究。体内实验中对于神经损伤再生的评估方法主要包括：功能评价：即坐骨神经指数和电生理检测，及形态学评价：包括骨骼肌横截面积的评估，有髓鞘轴突的数目及髓鞘厚度，超微结构的观察等。而对于靶器官的检测主要是形态学检测，如肌肉湿重比、肌肉纤维横截面积估算等，并未涉及功能检测。目前该研究尚未进入临床试验阶段。

5目前存在的问题

尽管对低强度脉冲超声在周围神经损伤中的研究比较多比较广泛，已经达到分子生物学水平，其对周围神经损伤后修复和再生的促进作用机制，目前报道的并不是很多，对于该机制的研究才刚刚起步，其具体机制、治疗强度频率周期、临床应用等问题仍然值得商榷。

尚待解决的问题主要有如下几个方面：(1)低强度脉冲超声促进周围神经细胞尤其是雪旺细胞增殖的分子生物学机制需要进一步证实；(2)急需找出低强度脉冲超声生物学效应的基因激活及表达调控机制，有待明确基因激活或抑制与蛋白表达产物的关系及细胞信号转导方面的作用机制；(3)有待寻找低强度脉冲超声治疗周围神经损伤修复的最佳刺激时间及强度频率周期等治疗参数，并早日应用于临床；(4)需要进一步探索低强度脉冲超声对自体神经翻转移植术后的神经是否有促进作用，以利于接轨于临床辅助治疗；(5)需要探索更多更新无创评价靶器官功能恢复状况的方法。

6展望

作为无创便捷、耐受性好、无不良并发症的治疗方法，低强度脉冲超声联合组织工程技术、多能分化潜能干细胞技术在周围神经损伤中的治疗，以及联合超声微泡造影靶向药物治疗的应用前景值得期待。

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The research progress of low-intensity pulsed ultrasound to promote peripheral nerve repair and regeneration

JIANG Wen-li1,2,TANG Jie1,WANG Yue-xiang1

(1.DepartmentofUltrasound,ChinesePeople'sLiberationArmyGeneralHospital,Beijing100853China；

2.DepartmentofUltrasound,BeijingHospital,Beijing100730,China)

Abstract:Nowadays,peripheral nerve injury is becoming the focus of social attention. Although microsurgery and tissue engineering provide new methods for repair and regeneration of peripheral nerve，their clinic effects are far from ideal. In recent years,different methods have been used to improve peripheral nerve recovery,such as physical stimulus like laser,electricity magnetic field,shock waves and ultrasound. And promising results have been achieved. Mechanical effect was recognized as main effect in the biologic action of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) while thermal mechanisms were not. Micromechanical stimulation and cavitation mechanisms played an important role. Mechanical strains may result in increasing enzyme activity and modifying cell metabolism. Studies showed that LIPUS could promote the permeability and selectivity of cell membrane and cell wall,enhance mass transfer and increase absorbing of nutritional elements. LIPUS has been proved to have therapeutic effect on a lot of tissue damage. The US Food and Drug Administration approved LIPUS for accelerating fresh fracture healing in 1994 and for the treatment of existing nonunions in 2000 separately. LIPUS could also promote healing in various soft tissues such as cartilage,intervertebral disc,etc. It could improve bone-tendon junction through effect on osseous tissue. The ultrasonic effect on the nervous system was first concerned in the early stage of the ultrasonic biological effect. Many studies have been performed to identify the potential mechanisms. Those studies mainly concentrated on continuous -ultrasound and the mechanisms were argued at thermal or non-thermal effects. Previous studies demonstrated that the therapeutic effect of LIPUS on Schwann cells or damaged rat sciatic nerve and explained the mechanism of LIPUS on peripheral nerve regeneration.As a noninvasive and convenient treatment,although low-intensity ultrasound still has many problems to be researched,its future and broad space for clinical application is confirmed.

Key words:peripheral nerve;regeneration and repair;low-intensity pulsed ultrasound

(收稿日期：2015-10-27，修回日期：2015-12-18)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.002

通信作者：唐杰，男，主任医师，博士生导师，研究方向：腹部与小器官疾病的超声诊断和介入治疗，E-mail：txiner@vip.sina.com

基金项目：国家自然科学基金(No 81327003)；国家自然科学青年科学基金(No 81100922)