费氏中华根瘤菌菌株HH103研究概述

石 杰， 高 宇， 刘 玉， 孙宇峰， 刘宇峰， 胡安·卡洛斯

(1.黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319；2.塞维利亚大学，西班牙 41012)



费氏中华根瘤菌菌株HH103研究概述

石 杰1， 高 宇1， 刘 玉1， 孙宇峰1， 刘宇峰1， 胡安·卡洛斯2

(1.黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319；2.塞维利亚大学，西班牙 41012)

摘要大豆既可以与快生型根瘤菌又可以与慢生型根瘤菌共生固氮。在以往的研究中，已有很多从不同地区的大豆根部分离出来的快生型根瘤菌，这些快生型根瘤菌大多数属于费氏中华根瘤菌属。模式菌株费氏中华根瘤菌菌株HH103现被用于基因序列的研究。该研究从根瘤和根瘤菌的分类依据和主要类型入手，介绍了HH103的主要研究现状，并且讨论其研究方向。

关键词费氏中华根瘤菌HH103；基因序列；大豆结瘤

根瘤菌隶属于α和β变形菌门，能够与豆科植物共生固氮。在根瘤菌与豆科植物之间复杂的分子水平物质交流的基础上，豆科植物的根部形成一种新的有机体形式——根瘤。在根瘤中氮气可以被固定，转化成铵态氮被植物吸收。从宏观的科学角度来讲，根瘤菌与豆科植物之间共生关系的研究发现的是原核生物与真核生物之间复杂的关系。这也为研究病原菌侵染动物或人预防严重疾病提供有力的科学证据。同时，在实际应用中，施用根瘤菌不但能够减少粮食种植成本，而且能减少环境污染。

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)HH103是世界上被发现较早的一株快生型根瘤菌，它以结瘤率高、宿主广谱等特点成为研究快生型根瘤菌的模式菌株。目前，全世界已获得全基因组序列的大豆根瘤菌菌株只有NGR234、USDA257和 HH103，其中快生型根瘤菌只有HH103。费氏中华根瘤菌HH103既可以与美国大豆品种共生固氮，又可以与亚洲大豆品种及其他多种豆科植物共生固氮。学者们对菌株HH103的研究已经达到一定深度，又因其结瘤率高，宿主范围广谱，一直作为根瘤菌研究的模式菌株。笔者从根瘤和根瘤菌的分类依据和主要类型入手，介绍了费氏根瘤菌HH103的主要研究现状，包括菌株HH103的基因组成、结瘤因子及表面多糖的研究进展，并且讨论了费氏菌株HH103的研究方向。

1根瘤及根瘤菌的分类概述

豆科植物的根瘤有2种类型，一种是定型根瘤，另一种是不定型根瘤。定型根瘤是球形的，分生组织活动只在早期进行，主要形成于热带和亚热带豆科植物根部。相反，不定型根瘤的分生组织活动是永久的，所形成的根瘤是圆柱形的，存在于温带豆科作物(如苜蓿和三叶草)根部。根瘤菌的分类方式较多，如根据代时，分为慢生型根瘤菌(6 h以上)和快生型根瘤菌(2~3 h)；根据基因组的构成，分为只有1条染色体组的和同时兼具质粒的根瘤菌；根据宿主植物不同，还分为专一和广谱型根瘤菌。实际上，根瘤菌和豆科植物的共生特异性很高。苜蓿中华根瘤菌就属于专一性根瘤菌，只能与少数豆科植物共生固氮，而费氏中华根瘤菌则是广谱型根瘤菌，能够与多种豆科植物共生固氮。

我国土壤中富含大量能够与大豆结瘤的细菌。最开始人们对根瘤菌的认知只限于慢生型根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，直到世界上第一株费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)于1982年从我国生长的大豆根瘤中分离出来[1]。此后，费氏菌株又相继在世界其他不同地区被分离出来，如新几内亚岛或西班牙格拉纳达。由于费氏菌株表现出非常优异的广谱特性，它是一种很好的用于研究竞争结瘤的模式菌株。

2费氏中华根瘤菌HH103

费氏中华根瘤菌HH103被分离于1985年中国湖北省洪湖县土壤中[2]，土样取自于传统的大豆种植区。种植品种主要是亚洲大豆品种欧皇三号。费氏中华根瘤菌菌株HH103能与美国和亚洲大豆品种共生结瘤，也能与很多其他豆科植物共生固氮，形成定型或不定型根瘤。有研究表明，能够与费氏菌株USDA257共生结瘤的豆科植物均能够与菌株HH103共生结瘤，而不能与费氏菌株USDA257共生结瘤的大多数美国农业上先进的大豆品种也能够与菌株HH103共生结瘤[3]。

2.1土著质粒构成质粒的琼脂糖凝胶电泳显示，费氏中华根瘤菌HH103中含有5种内源质粒。基因组测序分析证实了这5个质粒的存在，其中最大的2个质粒被称为pSfrHH103e和pSfrHH103d，大小分别为2.40和0.50 Mb，与根瘤菌NGR234的质粒构成类似[4]。据初步分析，HH103最大的质粒(pSfrHH103e)携带多种用于生产各种表面多糖如胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)、荚膜多糖(KPS)的基因；第二大质粒(pSfrHH103d)是一个典型的共生质粒(pSym)，结瘤固氮基因位于第二大质粒上。pSfrHH103c的电泳迁移率表明，该质粒略小于0.15 Mb。对质粒pSfrHH103b(61 880 bp)和pSfrHH103a(24 036 bp)序列的初步计算机分析显示，在质粒序列上存在大量的转座子，如它们每个都含有HH103中2个ISRf1拷贝中的一个。这是到目前为止只在费氏中华根瘤菌菌株中被发现的插入序列[5]。

2.2结瘤基因结瘤基因(nod、nol和noe)是指那些具有指导结瘤或共同配合调节基因作用的根瘤菌基因[6-7]。目前，对费氏中华根瘤菌HH103的结瘤基因即参与合成或分泌游离蛋白和作为调节基因的结瘤基因已有报道。除了nolR位于pSym质粒(pSfrHH103d)上，nolR调节基因位于细菌染色体上外，所有这些费氏中华根瘤菌HH103的nod基因的序列和分布都与根瘤菌NGR234相同。例如，它们都有2个nodD的拷贝(nodD1和nodD2)，在2株菌种中都有基因群组nolK-noeL-nodZ-noeK-noeJ-nodD1和nodA-nodB-nodC-nodI-NodJ-nolO-noeI-noeE。然而，虽然nolO基因能够在NGR234中起作用，但因为1型移码突变在HH103中存在不能发挥作用。

2.3结瘤因子根瘤菌产生脂几丁质寡糖信号分子，被称为LCOs或Nod因子，可用于应答植物产生的黄酮类化合物。目前，从大豆根部产生的最丰富的黄酮类化合物中分离出7，4′-二羟基异黄酮、染料木黄酮和香豆雌酚。植物黄酮类化合物与细菌的NodD蛋白相互作用，引起根瘤菌结瘤基因的转录激活。结瘤基因的表达最终导致结瘤因子的产生，从而引起根毛的卷曲和植物根瘤分生组织的分化。其核心骨架是乙酰氨基葡萄糖寡聚体，并且连接上一个不饱和脂肪酸，一些基团被不同程度地修饰。费氏中华根瘤菌HH103产生的结瘤因子与慢生型根瘤菌(如B.japonicum或B.elkanii)产生的结瘤因子结构上的不同主要是位于非还原末端的乙酰葡萄糖残基不同。在慢生型菌株中己糖可以携带甲基、乙酰基和/或氨基甲酰基。相反，费氏菌株HH103产生的结瘤因子则没有这些修饰[8]。

2.4表面多糖除了结瘤基因和结瘤因子，成功地定殖结瘤还需要根瘤菌表面分泌的各种多糖物质。环葡聚糖(CG)、胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)、荚膜多糖(KPS或K-抗原)是主要的根瘤菌多糖，它们在共生作用过程中起着举足轻重的作用。在根瘤菌菌株中，KPS只有在苜蓿中华根瘤菌、费氏中华根瘤菌株中略见报道。

2.4.1环葡聚糖(CG)。费氏根瘤菌HH103产生的CG只含有β-(1,2)糖苷键连接的葡萄糖残基，数目有18~24，磷酸甘油是其唯一的取代基。费氏中华根瘤菌HH103中cgs基因突变株不能产生CG，在任何豆科作物(包括形成定型根瘤的大豆和豇豆及形成不定型根瘤的乌拉干草)的测试中均不能使植物产生根瘤。这株费氏中华根瘤菌HH103cgs基因的突变株(SVQ562)还显示出其他表型性状的改变，如EPS的增加、EPS代谢物分子量的增加，以及移动性的缺失[9]。SVQ562在低渗的GYM培养基中比野生菌株生长得慢，说明突变株对低渗条件更加敏感。然而，SVQ562能够在蒸馏水中生存，说明HH103在极低渗溶液中生存不需要环葡聚糖。

2.4.2胞外多糖(EPS)。虽然对费氏中华根瘤菌HH103的 EPS的化学结构尚未测定，但已知携带了乙酰基和丙酮酸取代基。琥珀酰取代基的缺失说明exoH基因不存在于费氏菌株HH103的基因组中。与在苜蓿根瘤菌1021和大豆根瘤菌NGR234中的情况一样，费氏菌株HH103的exo基因簇位于最大的质粒(pSfrHH103e)上。据初步计算，发现调控基因exoS、exoR、mucR1和mucR2位于染色体上。不能产生EPS的突变株SVQ530(exoA基因突变)并不能降低它与大豆的共生能力，说明这种多糖在费氏菌株和大豆的共生系统中不起主导作用[10]。

2.4.3K-抗原或荚膜多糖(KPS)。参与KPS生物合成根瘤菌基因是在苜蓿根瘤菌RM41中被描述的。这些基因被称为rkp基因，分布于3个不同的被称为rkp-1、rkp-2和rkp-3的基因簇中。这3个不同基因簇同样存在于费氏中华根瘤菌HH103中。费氏中华根瘤菌HH103 的rkp-1区域位于染色体上，包含rkpU、rkpA、rkpG、rkpH、rkpI、rkpJ和kpsF3 7个不同的基因。所有这些rkp基因的突变株均不能产生KPS。大豆植株接种rkp基因的突变株会降低结瘤，并显示氮营养缺乏。

费氏中华根瘤菌HH103的rkp-2区域也位于染色体上，是由与苜蓿根瘤菌RM41rkp-2区域高度同源的2个基因(lpsL和rkpK)构成的。费氏菌株HH103在rkp2区域的突变株尚未构建。费氏中华根瘤菌HH103基因组测序表明，rkp-3区域位于pSfrHH103e质粒上，这个区域有6个基因存在于苜蓿根瘤菌中[11-12]。在根瘤菌NGR234中，rkpP基因是缺失的。其他参与KPS运输的基因(rkpR、rkpS和rkpT)或决定KPS链长度的基因(rkpZl)也在pSfrHH103e质粒上。目前研究结果表明，费氏菌株HH103与大豆共生的能力与KPS而不是EPS有关。

2.4.4脂多糖(LPS)。脂多糖是大多数革兰氏阴性菌的胞外成分。据推测，根瘤菌LPS可以保护细菌免受植物产生抗菌化合物的伤害。费氏中华根瘤菌HH103的LPS化学结构尚未确定。只有2个费氏中华根瘤菌HH103的脂多糖基因的突变株已被构建和研究。初步结果表明，lpsB或lpsE的突变株可以改变LPS的蛋白质电泳结果，同时降低与大豆共生固氮的能力。

3展望

费氏菌株与慢生型根瘤菌都能够与大豆共生固氮，而与它们关系密切的苜蓿根瘤菌和根瘤菌NGR234却不能。因

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A Research Review onSinorhizobiumfrediiHH103

SHI Jie,GAO Yu,LIU Yu et al (Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences,Daqing,Heilongjiang 163319)

AbstractGlycinemax(soybean) plants can be nodulated by fast-growing rhizobial strains of the genusSinorhizobiumas well as by slow-growing strains clustered in the genus Bradyrhizobium In the past research fast-growing rhizobia strains with different soybean cultivar specificities were isolated from various geographical regions.Most of these strains were clustered into the speciesSinorhizobiumfredii.The largest plasmid (pSfrHH103e) harbours genes for the production of diverse surface polysaccharides,such as exopolysaccharides (EPS),lipopolysaccharides (LPS),and capsular polysaccharides (KPS).The second largest plasmid (pSfrHH103d) is a typical symbiotic plasmid (pSym),carrying nodulation and nitrogen fixation genes.The model strainS.frediiHH103 was chosen for genomic sequencing,which is currently in progress.Starting from classification basis and main types of nodule and rhizobial strains the research status of HH103 was introduced,and the research direction in the future was forecasted.

Key wordsSinorhizobiumfrediiHH103; Genome sequence; Soybean nodulation

收稿日期2015-12-14

作者简介石杰(1984- )，女，黑龙江大庆人，助理研究员，从事微生物与植物营养方面的研究。

中图分类号S 182

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)02-007-02