水环境中重金属铜暴露下青鳉鱼的行为响应

2016-03-17梁鸿刘勇饶凯锋马梅许旺唐亮马嵩潘晓峰陈慧明杨莹莹

生态毒理学报 2016年6期

梁鸿，刘勇，饶凯锋，马梅，许旺，唐亮，马嵩，潘晓峰，陈慧明，杨莹莹

1. 深圳市环境监测中心站，深圳 518049 2. 中科水质(无锡)环境技术有限公司，无锡 214024 3. 中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京 100085 4. 中国科学院生态环境研究中心中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京 100085 5. 中国科学院大学资源与环境学院，北京 101407 6. 广东省环境监测中心，广东 510308

水环境中重金属铜暴露下青鳉鱼的行为响应

梁鸿1，刘勇2,*，饶凯锋3,#，马梅4,5，许旺1，唐亮2，马嵩1，潘晓峰1，陈慧明6，杨莹莹2

采用生物行为传感器监测青鳉鱼在重金属铜暴露下的行为数据，分析不同暴露浓度(20、10、5、1和0.1 TU)下青鳉鱼的行为响应。20、10、5、1和0.1 TU的暴露浓度下青鳉鱼对重金属污染的行为反应模式符合环境胁迫阈值模型，且不同浓度梯度重金属对青鳉鱼产生不同的行为毒性效应。利用重金属作用下青鳉鱼的行为变化来研究重金属环境胁迫导致的生物行为响应机制，从而得到重金属暴露下生物行为的实时变化过程和趋势，可对水环境生态系统质量进行综合评价。

重金属；铜；青鳉鱼；行为响应；水质评价

近年来突发性水污染事故的发生，如污染源事故性排放、工业化学品运输泄漏以及人为投放有毒物质等事件，给水生态安全和公众健康造成了极大的危害[1-2]。环境污染物中铜是常见的重金属有毒污染物，主要来自冶炼加工、机械制造及电镀、化工、矿山开采等的污染排放[3]。有毒污染物是指一类对生物体能够产生毒害影响的污染物，可能导致生物体生理、生态改变等一系列危害。通过生物传感器可监测水体内指示生物不同水平上的生物学参数变化，从而反映水质综合毒性，因此生物传感器可以用于有毒物质污染事件的在线监测和预警[4]。

在一定的环境胁迫下，生物对外界环境变化进行适应的首要体现在生物行为反应上。所以当外界环境因子发生改变时，生物运动行为的改变是一种主动的“逃避”方式，并通过行为调节机制保持生物体内在生理环境的稳定，以快速适应外界环境变化。因此，生物行为状态的由强至弱或由弱至强是外界环境变化导致其死亡前的早期诊断指标。如果水生生物异常的行为改变能被监测到，则说明外界水环境内关系到水生生物生存的因子的变化接近或超出了其生存的正常范围，并可由此对水质变化程度进行分析[5]。

基于生物行为生态学的水质生物预警监测技术是通过生物行为传感器监测水体内受试水生生物行为变化，可以进行连续实时在线监测，以实现水环境污染事故的快速分析，对水质的变化进行监测预警。由于生物监测技术的简便快捷，欧美国家在此基础上开发水质在线生物监测设备，最早运用是在欧洲，德国从1990年开始就先后将该系统成功地运用于多个河流。目前国内在线生物监测技术包括发光菌监测技术[6]、水溞监测技术、藻类监测技术和鱼类监测技术等，尽管起步较晚，但由于其具有简便快捷、直观的技术优势并适合我国水环境污染现状，已经逐步应用于水体突发性污染事故的在线监测预警。水环境水质生物监测预警体系方面的研究多侧重于饮用水源水，一些城市已初步构建了水源水在线监测预警系统[7]。

本研究通过生物行为传感器监测受试生物青鳉鱼暴露于被监测水体内的行为变化，获取青鳉鱼在污染物暴露下的特征性行为模式。青鳉鱼(Oryzias latipes)属于鳉科鱼种，个体小对污染物敏感性高，生命周期一般在2年左右，可以耐受较宽的溶解氧和水温范围[5]。自从Denny[8]对青鳉鱼的繁殖管理与毒理实验操作进行了规范化后，由于其具有非常充分的生物学背景研究基础，青鳉鱼作为毒理学标准模式生物应用广泛[9]，为国际标准化组织认定的毒理学实验标准物种之一，其中中国科学院生态环境研究中心已利用青鳉鱼制定多个水质评价标准。目前，水质监测技术已经将青鳉鱼的行为变化经作为一个重要指标进行应用[10]。

本研究利用重金属作用下青鳉鱼的行为变化来分析的环境胁迫导致的生物行为变化机制，基于在实际水质环境下青鳉鱼的行为反应过程，发展重金属环境胁迫下生物行为胁迫阈值模型。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 监测系统

采用生物行为传感器对青鳉鱼行为数据进行提取。由于不同的模式生物个体大小不同，需要匹配不同型号生物行为传感器：标准模式青鳉鱼采用直径为6 cm、高20 cm的双层生物行为传感器。其中生物行为传感器为中国科学院生态环境研究中心与中科水质(无锡)环境技术有限公司联合研制，并形成拥有自主知识产权的“水质在线生物安全预警系统(BEWs)”的产业化能力，已在我国饮用水水源地广泛应用，为饮用水水质安全提供安全保障。

1.2 生物培养

标准模式青鳉鱼采用流水繁殖，繁殖温度为25 ℃±2 ℃，光照周期16 h∶8 h。幼鱼孵出2 d后，需投喂刚孵出的丰年虾幼虫作为开口饵料，每天早晚进行2次投喂。2周后可配合饲料投喂，每天投喂2次。养殖密度保持在每升水2～3条[11]。本实验采用中科水质(无锡)依据毒理学规范培养的性成熟青鳉鱼不久的成鱼，鱼龄为3月龄。

1.3 实验设计

本实验采用流水环境下的生物行为传感器(图1)提取青鳉鱼行为数据，传感器分为双层，上层为暴露层，放置受试生物，下层为行为数据背景层，不放置受试生物。

在污染物流水暴露实验过程中，选取五水合硫酸铜作为实验药品。将重金属铜对青鳉鱼的48 h半数致死剂量(50% lethal concentration of 48 h)，LC50, 48 h作为1个毒性单位(toxic unit, TU)[12]，实验设定5个浓度梯度，分别为20、10、5、1和0.5 TU。每个浓度梯度污染物采用8通道平行生物行为传感器进行测试。

在实验中，采用生物综合行为强度(behavior strength)来反映其行为变化[12]，在青鳉鱼流水暴露实验过程中，每通道保持3条2.5～3.0 cm体长的健康性成熟青鳉鱼。实验过程中不投加食物，并控制每个通道水体流速2 Lh-1[12-14]。

实验用水为曝气充分的自来水，温度25 ℃±2 ℃，溶解氧>8 mgL-1，硬度以CaCO3计，(250±25) mgL-1，控制光照周期16 h∶8 h(白天∶黑夜，白天04:00—20:00，夜间21:00—04:00)，为保证各浓度梯度生物行为监测前的平行，每次浓度梯度监测实验开始于第1天上午16:00，第3天上午16:00结束[14]。每个浓度梯度暴露实验开始前，需将青鳉鱼置于充满无污染水的生物行为传感器中适应2 h后通入所需浓度梯度重金属溶液，直至48 h后实验结束。

图1 生物行为传感器Fig. 1 Biological behavior sensor

2 结果(Results)

由静水暴露实验得出：重金属Cu2+对青鳉鱼48 h半数致死计量为4.8 mgL-1。在本研究中，以Cu2+的LC50,48 h作为青鳉鱼行为毒性的1个毒性单位(1 TU)研究不同浓度梯度污染物暴露下的青鳉鱼的行为强度变化响应。

不同浓度梯度Cu2+作用下青鳉鱼48 h的行为强度变化如图2所示。青鳉鱼暴露于0.1 TU浓度Cu2+中的行为强度变化结果中，在暴露开始阶段青鳉鱼行为强度基本保持在0.2至0.8之间，但其最大值为0.1或0.9左右，最小值位于0.5左右，尤其在暴露时间4 h左右和32 h左右，青鳉鱼行为强度有明显降低过程。低浓度暴露梯度下青鳉鱼行为强度变化的主要原因在于青鳉鱼内在行为变化的周期节律现象，即生物钟现象(biological clock)[15-17]。因此，在不同浓度梯度(尤其是小于1 TU)的重金属作用下青鳉鱼的行为变化模式分析中，应该将青鳉鱼行为变化中周期节律现象(生物钟)的影响作为重要参考。

随着暴露浓度梯度的升高，各个浓度梯度之间青鳉鱼行为强度变化明显。在高浓度梯度(5、10和20 TU)暴露过程中，青鳉鱼行为强度出现一个短暂升高后又逐渐降低的变化过程后，迅速趋于0.5(死亡)。在低浓度梯度(1和0.1 TU)暴露中，青鳉鱼行为变化过程以自我适应为主(行为调整过程)，并且其自我适应过程具有明显周期节律现象(生物钟)。但是，在暴露后期该低浓度梯度中青鳉鱼的行为强度出现降低趋势，这是由于行为毒性累积造成的。

在不同浓度梯度的48 h的暴露中，青鳉鱼行为强度变化与暴露时间具有明显规律性变化[12]。在图2中，20 TU浓度梯度暴露初期，青鳉鱼行为强度维持在0.2至0.8之间，但随暴露时间增加，尤其在1 h以后，青鳉鱼行为强度降低明显，在此过程中，自我适应行为过程不明显。大约在2 h左右，行为强度接近零，直至死亡。而在10 TU和5 TU的浓度梯度暴露过程中，青鳉鱼行为强度降低明显所需时间分别为2 h和3 h之间，同时，自我适应行为过程明显多于20 TU浓度梯度。

暴露浓度梯度越高，青鳉鱼行为变化过程越剧烈，而随暴露浓度梯度降低，青鳉鱼行为自我适应过程增加。故在一定的暴露时间内，青鳉鱼行为强度变化过程与水环境内污染物浓度密切相关。

3 讨论(Discussion)

从青鳉鱼行为强度变化过程与暴露时间和暴露浓度综合分析：在重金属铜暴露浓度固定的情况下，青鳉鱼行为强度变化随暴露时间出现与之对应的行为规律性变化过程；而在同样48 h暴露过程中，行为强度变化与暴露浓度有明显的剂量效关系。同时，当外界环境出现污染之后，青鳉鱼行为变化首先表现在自我适应过程，直至毒性累积产生明显行为毒性效应[14]。在青鳉鱼的自我适应过程中，外界环境污染形成的环境胁迫阈值是青鳉鱼产生行为变化的主因。

图2 不同浓度梯度Cu2+暴露下青鳉鱼48 h行为强度变化注：以Cu2+的LC50,48 h作为青鳉鱼行为毒性的1个毒性单位(1 TU)。Fig. 2 The effects of different concentration of Cu2+ on the behavior strength of medaka in 48 hours exposureNote: 1 TU was based on the LC50,48 h of Cu2+ for the behavior strength of medaka.

图3 环境胁迫阈值模型[18]Fig. 3 Environment stress model[18]

青鳉鱼行为变化过程与暴露时间和暴露浓度之间的关系，符合如图3所示环境胁迫阈值模型[18]。

环境胁迫阈值模型中，暴露污染物浓度产生的环境胁迫是影响青鳉鱼行为强度变化过程(回避行为)持续的时间长短主要原因，并具有明显规律性，并决定了青鳉鱼接触污染环境后行为增强的持续时间和强度[18]。环境胁迫越大，回避行为强度越高，过程越短，胁迫阈值1对青鳉鱼产生的压力越大，在自我适应失效以后，青鳉鱼的行为毒性效应会直接出现。在较强且持续的环境胁迫下，在经历行为自我适应过程，青鳉鱼经过行为调整后，胁迫阈值2将会作用于青鳉鱼行为反应。所以，青鳉鱼行为调整，尤其是在行为增强产生以后，既受环境污染物浓度影响，又与污染物暴露时间相关[18-19]。

通过本研究利用重金属作用下青鳉鱼的行为变化来分析研究环境胁迫导致的生物行为响应机制，发展一定环境胁迫下生物行为胁迫阈值模型，丰富水质在线连续实时生物监测预警的生物毒性数据模型。因此将在一定环境污染胁迫下受试水生生物行为生态学变化与正常水体内受试水生生物行为生态学变化进行解析，得到一定环境胁迫下受试水生生物运动行为的规律性变化，并在此基础上对生物行为变化趋势进行模式识别和实时解析，从而得到生物相对行为的实时变化过程和趋势，能够对水环境生态系统质量进行综合性评价。

[1] 洪维民. 加强预警监测体系建设高效应对突发生态环境问题[J]. 环境监测管理与技术, 2009, 21(2): 1-3, 11

Hong W M. Strengthening warning system of environmental monitoring efficiently dealing with local eco-environmental emergency [J]. The Administration and Technique of Environmental Monitoring, 2009, 21(2): 1-3, 11 (in Chinese)

[2] 邱祖楠. 完善应急监测网络提高环境管理能力[J]. 环境监测管理与技术, 2008, 20(2): 4-6

Qiu Z N. Perfecting Guangdong emergency monitoring network for improvement of environmental management capability [J]. The Administration and Technique of Environmental Monitoring, 2008, 20(2): 4-6 (in Chinese)

[3] 曾丽璇, 陈桂珠, 余日清, 等. 水体重金属污染生物监测的研究进展[J]. 环境监测管理与技术, 2003, 15(3): 12-15

Zeng L X, Chen G Z, Yu R Q, et al. Review of biological monitoring about water heavy metal pollutants [J]. The Administration and Technique of Environmental Monitoring, 2003, 15(3): 12-15 (in Chinese)

[4] 王子健, 饶凯锋. 突发性水源水质污染的生物监测、预警与应急决策[J]. 给水排水, 2013, 39(10): 1-3

[5] Putman R J, Wratten S D. Principles of Ecology [M]. London and Canberra: Groom Helm LTD, 1984: 200-201

[6] 黄灿克. 发光细菌毒性法在水质评估与预警中的应用研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2014: 12-16

Huang C K. The application of photobacteria toxicity detection method in water quality [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014: 12-16 (in Chinese)

[7] 张奇磊, 高琦, 沈琰. 饮用水源地水质预警系统的建立和应用研究[J]. 环境科学与管理, 2014, 39(2): 123-125

Zhang Q L, Gao Q, Shen Y. Construction and application of water quality warning system in drinking water source [J]. Environmental Science and Management, 2014, 39(2): 123-125 (in Chinese)

[8] Denny J S. Guidelines for the Culture of Fathead Minnows for Use in Toxicity Tests. EPA /600/3-87/001. [R]. Duluth, Minn.: Environmental Research Laboratory, 1987

[9] Yamamoto T. Medaka (Killifish):Biology and Strains Keigaku [M]. Tokyo: Keigaku Pub Co, 1975: 22

[10] Shioda T, Wakabayashi M. Effect of certain chemicals on the reproduction of medaka (Oryzias latipes) [J]. Chemosphere, 2000, 40: 239-243

[11] Teather K, Harris M, Boswell J, et al. Effects of Acrobat MZ and Tatto C on Japanese medaka (Oryzias latipes) development and adult male behavior [J]. Aquatic Toxicology, 2001, 51: 419-430

[12] 刘勇, 付荣恕, 等. 2种有机磷农药联合胁迫下日本青鳉的逐级行为响应[J]. 环境科学, 2010, 31(5): 1328-1332

Liu Y, Fu R S, et al. Stepwise behavioral responses of the Japanese medaka under the joint stress of two organophosphorus pesticides [J]. Environmental Science, 2010, 31(5): 1328-1332 (in Chinese)

[13] Guilhermino L, Diamantino T, Silva M C, et al. Acute toxicity test with Daphnia magna: An alternative to mammals in the prescreening of chemical toxicity [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2000, 46: 357-362

[14] 刘勇, 张高生, 陈琳琳, 等. 2种除草剂联合胁迫下日本青鳉的逐级行为响应[J]. 生态毒理学报, 2010, 5(1): 32-37

Liu Y, Zhang G S, Chen L L, et al. The stepwise behavioral responses of the Japanese medaka under the joint stress of two herbicides[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(1): 32-37 (in Chinese)

[15] Binkley S A, Riebman J B, Reilly K B. The pineal gland: A biological clock in vitro [J]. Science, 1978, 202: 1198-1120

[16] Wang G, Fu C, Li J, et al. Circadian rhythms and different photoresponses of Clock gene transcription in the rat suprachiasmatic nucleus and pineal gland [J]. Acta Physiologica Sinica, 2006, 58: 359-364

[17] 刘勇. 环境污染物联合胁迫下水生生物行为响应研究[D]. 济南: 山东师范大学, 2010: 34-37

Liu Y. Study on behavioral responses of the aquatic organisms under the joint stress of environmental pollutants[D]. Jinan: Shandong Normal University, 2010: 34-37 (in Chinese)

[18] Gerhardt A, de Bisthoven L J, Mo Z, et al. Short-term responses of Oryzias latipes (Pisces: Adrianichthyidae) and Macrobrachium nipponense (Crustacea: Palaemonidae) to municipal and pharmaceutical wastewater in Beijing, China: Survival, behavior, biochemical biomarkers [J]. Chemosphere, 2002, 47: 35-47

[19] 刘勇, 张高生, 陈琳琳, 等. Cd2+与2,4,6-TCP联合胁迫下日本青鳉的逐级行为响应[J]. 供水技术, 2010, 4(4): 1-4

Liu Y, Zhang G S, Chen L L, et al. Stepwise behavioral responses of Japanese medaka (Oryzias latipes) under the joint stresses of Cd2+and 2,4,6-TCP [J]. Water Technology, 2010, 4(4): 1-4 (in Chinese)

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The Behavioral Responses of the Medaka under the Stress of Heavy Metal Copper in Water Environment

Liang Hong1, Liu Yong2,*, Rao Kaifeng3,#, Ma Mei4,5, Xu Wang1, Tang Liang2, Ma Song1, Pan Xiaofeng1, Chen Huiming6, Yang Yingying2

1. Shenzhen Environmental Monitoring Center, Shenzhen 518049, China 2. CASA (Wuxi) Environmental Technology Co., Ltd, Wuxi 214024, China 3. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China 4. Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China 5. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101407, China 6. Guangdong Environmental Monitoring Center, Guangdong 510308, China

Received 6 December 2016 accepted 20 December 2016

In this study, behavioral data for medaka (Oryzias latipes) exposed to the heavy metal Cu2+were monitored using bio-behavioral sensors, to analyze the behavioral responses of medaka at different exposure concentrations (20, 10, 5, 1 and 0.1 TU). The behavioral response profiles of medaka to Cu2+were in accordance with the environmental stress threshold model. And Cu2+at different concentrations had different behavioral toxic effects on medaka. According to the behavioral response mechanism of environmental stress caused by heavy metals, we can obtain the real-time change profiles and trends of biological behavior for medaka under heavy metal pollution. Furthermore, it can be also used for the comprehensive assessment of water ecological quality.

heavy metal; copper; medaka (Oryzias latipes); behavioral responses; water quality evaluation.

863课题(2014AA06A506)；中国科学院科技服务网络计划(STS计划)：KFJ-SW-STS-171

梁鸿(1966-)，男，北京大学地球物理系本科，研究方向为城市生态监测，E-mail: szlhong@szhec.gov.cn；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: liuy@casaet.com

10.7524/AJE.1673-5897.20161206001

2016-12-06 录用日期：2016-12-20

1673-5897(2016)6-345-08

X171.5

刘勇(1983-)，男，高级工程师，主要研究方向为生物行为学、水生态毒理学和生物在线监测预警。

饶凯锋(1976-)，男，助理研究员，主要研究方向为水生态毒理学、生物在线监测预警和环境监测预警物联网。

# 共同通讯作者(Co-corresponding author)， E-mail: raokf@rcees.ac.cn

梁鸿, 刘勇, 饶凯锋, 等. 水环境中重金属铜暴露下青鳉鱼的行为响应[J]. 生态毒理学报，2016, 11(6): 345-352

Liang H, Liu Y, Rao K F, et al. The behavioral responses of the medaka under the stress of heavy metal copper in water environment [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 345-352 (in Chinese)