羰基镍急性中毒对大鼠骨髓细胞的DNA损伤

赵亚学，李宇，马国煜，刘静，王秋英，张小培，宣小强，闫铭锋，吴喜江，程宁

1. 兰州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所，兰州 730000 2. 兰州大学甘肃省新药临床前研究重点实验室，兰州 730000 3. 金川集团股份有限公司职工医院，金昌 737103

羰基镍急性中毒对大鼠骨髓细胞的DNA损伤

赵亚学1,2，李宇1，马国煜3，刘静1，王秋英3，张小培1，宣小强3，闫铭锋1，吴喜江3，程宁2,*

1. 兰州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所，兰州 730000 2. 兰州大学甘肃省新药临床前研究重点实验室，兰州 730000 3. 金川集团股份有限公司职工医院，金昌 737103

通过动物实验观察不同剂量羰基镍对大鼠骨髓细胞DNA损伤程度。采用SD大鼠，以135 mg·m-3和250 mg·m-3羰基镍为染毒组，250 mg·m-3氯气为阳性对照组，静态方式染毒30 min。未染毒组为正常对照组，大鼠染毒后1、2、3和7 d分别采集样本。采用单细胞凝胶电泳检测每组大鼠骨髓细胞DNA的损伤程度。彗星尾长和Olive尾矩2个指标的分析结果表明，大鼠骨髓细胞DNA损伤程度随着羰基镍染毒剂量的增加而增加，在4个时间点各剂量组间均有显著差异(P<0.05)且随时间的变化有一定的规律，损伤程度在3 d时达到最大，而后缓慢下降。羰基镍急性中毒对大鼠骨髓细胞DNA有一定的损伤，且存在剂量-效应关系，各剂量组损伤程度有一定的时间效应规律。

羰基镍；SD大鼠；DNA损伤；单细胞凝胶电泳；骨髓细胞

羰基镍(nickel carbonyl)是由镍和一氧化碳在一定压力条件下反应生成的一种金属化合物，进入体内的羰基镍与蛋白质和核酸结合，随血流分布到全身，可导致肺、肝、脑等的损伤[1]。羰基镍致器官、组织、细胞等损伤的研究较多，我们前期研究发现羰基镍可导致肺组织和肝组织的氧化损伤，降低肺组织和肝组织SOD活力，对肺脏和肝脏产生毒性作用[2-4]，同时发现羰基镍可诱导脑组织的氧化应激反应而产生神经毒性[5]。Armit[6]观察到了人在羰基镍急性中毒后出现呼吸困难、眼花、呕吐，随后几天出现发绀、咳嗽、血痰、脉搏加快、神智错乱等症状，严重者甚至死亡。但以往研究中对羰基镍致骨髓细胞损伤的研究较少，本研究旨在对羰基镍骨髓细胞DNA的损伤程度进行研究，揭示羰基镍对大鼠骨髓细胞DNA的损伤作用规律。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 动物分组与染毒

由西安交通大学基础医学实验动物中心提供的体重在180～220 g之间的雌雄各半的SD大鼠。按照性别随机分成4个组，1个正常对照组(8只)以及3个染毒组(40只/组)分别定义为A、B、C、D组。万级洁净动物房分笼饲养，SPF级大鼠饲料(北京科澳协力饲料有限公司)喂养，自由采食及饮水。

135 mg·m-3、250 mg·m-3的羰基镍和250 mg·m-3的氯气静态方式染毒30 min。4组动物染毒后分别于1、2、3和7 d这4个时间点随机处死2、10、10、10只，取材。

1.2 单细胞凝胶电泳实验

按常规单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis, SCGE)实验进行操作和分析。运用CASP彗星分析软件测量所选骨髓细胞的彗星尾长(comet tail length)和Olive尾矩(Olive tail moment)，将彗星尾长和Olive尾矩作为实验观察指标，具体仪器及操作过程详见文献[7]。

1.3 统计学分析

采用SPSS21.0对数据进行统计分析，对于不符合正态要求的数据经对数转换后进行分析，多组样本均数之间的比较采用方差分析，多组样本均数间的多重比较采用LSD法，剂量-反应关系采用Spearman等级相关分析法，对于相关性的组别做线性或曲线回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果(Results)

2.1 羰基镍急性染毒后大鼠骨髓细胞彗星尾长和Olive尾矩的变化趋势

从表1可以看出，各个时间段不同羰基镍染毒剂量组间彗星尾长和Olive尾矩随着染毒剂量的增加而增加。各染毒剂量组在3 d时尾长和Olive尾矩达到最大，在7 d时均开始下降。经LSD法多重比较可以看出，未染毒组与3个染毒组的尾长和Olive尾矩均数之间均有差异(P<0.05)。氯气组在染毒后各个时间点的彗星尾长和Olive尾矩也明显高于未染毒组，且最大损伤程度出现在染毒后2 d，但最大损伤程度小于羰基镍高剂量组的最大损伤程度。

分组Groups染毒剂量Exposuredoses1d2d3d7d彗星尾长ComettaillengthA03.58±1.33#3.58±1.33#3.58±1.33#3.58±1.33#B135mg∙m-3nickelcarbonyl21.62±1.76*#20.64±1.64*36.47±1.60*#8.49±1.48*C250mg∙m-3nickelcarbonyl26.90±1.59*#23.17±1.72*31.55±1.31*#7.60±1.57*D250mg∙m-3chlorine16.97±1.33*21.91±1.32*21.00±9.50*9.04±1.63*Olive尾矩OlivetailmomentA00.173±2.375#0.173±2.375#0.173±2.375#0.173±2.375#B135mg∙m-3nickelcarbonyl2.536±1.784*#2.485±1.939*5.995±1.658*#0.917±1.680*C250mg∙m-3nickelcarbonyl3.538±1.843*#2.540±1.800*5.887±1.533*#0.809±1.744*D250mg∙m-3chlorine2.646±5.292*3.544±1.435*2.430±2.091*1.036±1.768*

注：* 为经LSD法多重比较；同时间点，与A组比较，P<0.05；#为与D组比较，P<0.05。

Note: * By using the line segment detector (LSD) method; compared with A, at the same time P<0.05; # compared with D, P<0.05.

2.2 相同时间点不同剂量组间及相同剂量组不同时间点的相关性及回归分析

经过Spearman相关性分析发现同一时间不同剂量组之间，同一剂量组不同时间的各组均有相关性(表2)，从表中还可以看出同一时间点不同剂量组之间除了第7天时的Olive尾矩之外几乎都呈线性相关，即随着剂量的增加，彗星尾长、Olive尾矩都在增加，存在着明显的剂量-效应关系。第7天时回归方程呈现曲线相关，从方程看出，在第7天时Olive尾矩不再随着剂量的增加而增加，而是出现缓慢下降状态，这可能是由于羰基镍对骨髓DNA的损伤剂量达到一定程度后，机体开始将外源化学物质排泄出体外，不会再加重损伤效应，故Olive尾矩不再增长。表中还可看出同一剂量组不同时间点之间呈现曲线相关，曲线回归方程表明，羰基镍染毒各个剂量组中DNA的损伤在染毒3 d时损伤程度均达到最大，而在7 d时损伤程度都逐渐变小，这可能因为外源化学物质排出体外，浓度减少。

3 讨论(Discussion)

羰基镍是镍化合物中急性毒性最强的一种，短时间大剂量吸入可累及到多种脏器及器官，包括对肝脏、肺脏、心脏及脑组织的损伤。以往对羰基镍致动物或人体损伤的研究较多，但其制毒的细胞及分子机制仍不完全清楚。有研究表明镍化合物可引起机体氧化应激反应，产生超氧阴离子自由基，导致细胞突变及肿瘤的发生[8-9]。还有研究得出羰基镍是通过抑制Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶的活性，导致组织/器官细胞浆内游离钙增多引起组织细胞损伤，影响肝肺等脏器功能[2-3]。Armit[6]的研究显示羰基镍吸入后在呼吸道表面进入血液或淋巴液，在接触到水、血液等体液的情况下如果有氧气或者二氧化碳的存在，分解产生碳酸盐化合物，形成沉淀，分布在肺部、大脑、脊髓束、心肌、棕色脂肪、肾上腺皮质等处，刺激神经节和肾上腺实质细胞引起毛细血管内皮细胞的退变，引起血管壁脂肪变性和出血，同时机体也会通过肾脏和肠道将其排出体外。Sunderman等[10]在对怀孕仓鼠进行研究的过程中发现仓鼠吸入一定浓度羰基镍后产生胎盘毒性对后代有致畸效应。骨髓是维持机体生命和免疫力的重要器官，骨髓细胞DNA的损伤严重影响机体的正常运行。

本实验结果显示，大鼠吸入不同浓度羰基镍后各时间点随羰基镍浓度的增加，DNA断链片断也增多，尾长增加，呈现明显的剂量-效应关系，这种关系估计是随着羰基镍浓度的升高，DNA的修复功能不能与越来越严重的损伤相平衡，从而使DNA的损伤加重所致。但Olive尾矩在一定时间后不再随着剂量的升高而加重，这可能是大剂量的羰基镍进入体内对机体的损伤严重，机体调动排泄系统加大毒物排泄，一定时间后毒物在体内的分布减少所致。相同剂量，不同时间点测量的尾长和Olive尾矩变化也有一定规律，在染毒后3 d时，DNA的损伤程度均达到最重，在7 d时开始下降。此结果与Barnes和Denz[11]的研究结果一致，他们发现羰基镍急性中毒后，死亡病例一般发生在前3 d，存活者中毒症状也以前3 d最为明显，7 d后症状逐渐减轻。氯气染毒组各时段骨髓细胞DNA的损伤程度均低于羰基镍高剂量组，这说明相同剂量羰基镍致大鼠骨髓细胞DNA的损伤程度比氯气严重。

表2 同一时间不同剂量组间和同一剂量不同时间点间相关性分析及回归方程Table 2 The correlation analysis and regression equations among different doses and different times

注：* 相关性分析P<0.05，r为相关系数，Y为回归方程。

Note: * P<0.05 by the correlational analysis, r stands for correlation coefficient, Y stands for regression equation.

外周血中的各种细胞均由骨髓中的始祖细胞分化而来，处于不同发育、分化阶段的血细胞对外源化学物敏感性较高，因此，血液系统比其他身体器官更容易受到外源化学物的损伤。本研究结果表明，羰基镍对大鼠骨髓细胞DNA损伤严重，具有骨髓毒性，且损伤程度与羰基镍存在时间-效应规律和剂量-效应关系。

致谢：感谢金川公司镍钴工业卫生研究所祁光伟、徐东伟、黄克英在动物饲养方面的帮助！感谢兰州大学张荣强、芦永斌、常晓宇在样本处理和数据统计上的帮助！

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◆

DNA Damage in Bone Marrow Cells of Rat Acutely Poisoned with Nickel Carbonyl

Zhao Yaxue1,2, Li Yu1, Ma Guoyu3, Liu Jing1, Wang Qiuying3, Zhang Xiaopei1, Xuan Xiaoqiang3, Yan Mingfeng1, Wu Xijiang3, Cheng Ning2,*

1. Institute of Epidemiology and Statistics, School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. Provencial Key Preclinical Study Laboratory of New Drug, Lanzhou 730000, China 3. Staff Hospital, Jinchuan Group Co., Ltd., Jinchang 737103, China

Received 23 March 2016 accepted 23 May 2016

In order to study the DNA damage induced by nickel carbonyl in rat bone marrow cells, 128 healthy SD rats were divided into four groups to conduct 30 min static inhalation experiments. SD rats in the two exposure groups were exposed to a nickel carbonyl concentration of 135 mg·m-3and 250 mg·m-3, and the rats were exposed to 250 mg·m-3Cl2in the positive control group. 8 unpoisoned rats served as the blank control. After rats inhaled for 1, 2, 3 and 7 d, bone marrow samples were taken. SCGE was used to detect the acute injury extent. The comet tail length and Olive tail moment in the comet image were measured. In nickel carbonyl groups, extreme DNA damage was found after 3 d, and the DNA damage was decrease after 7 d. Higher nickel carbonyl dose caused greater DNA damage. It is indicated that acute nickel carbonyl exposure caused DNA damage in the bone marrow cells of the SD rats, with a dose-response and time-response relationship.

nickel carbonyl; SD rats; DNA damage; single-cell gel electrophoresis; bone marrow cell

金川集团股份有限公司与兰州大学产学研合作项目(金科综2009-12和2011-18)

赵亚学(1990-)，女，硕士研究生，研究方向为重金属中毒防治，E-mail: yxzhao14@lzu.edu.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: chengn@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160323061

2016-03-23 录用日期：2016-05-23

1673-5897(2016)6-230-04

X171.5

A

程宁(1959)，男，教授，研究方向为安全性评价。

赵亚学, 李宇, 马国煜, 等. 羰基镍急性中毒对大鼠骨髓细胞的DNA损伤[J]. 生态毒理学报，2016, 11(6): 230-233

Zhao Y X, Li Y, Ma G Y, et al. DNA damage in bone marrow cells of rat acutely poisoned with nickel carbonyl [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 230-233 (in Chinese)