乳粉中阪崎克罗诺杆菌快速检测方法应用比较

王淞，张霞，王伟，李莉，朱振元（1.天津科技大学，天津00457；.天津出入境检验检疫局，天津00456；.青海出入境检验检疫局，青海西宁810099）



乳粉中阪崎克罗诺杆菌快速检测方法应用比较

王淞1，2，张霞1，2，王伟2，李莉3，朱振元1，*
（1.天津科技大学，天津300457；2.天津出入境检验检疫局，天津300456；3.青海出入境检验检疫局，青海西宁810099）

摘要：对几种应用较为广泛的阪崎克罗诺杆菌分子生物学检测技术进行比较分析，探求适用于食品实验室检验要求的快速准确的阪崎克罗诺杆菌检测方法。通过DNA灵敏度检测及样品添菌实验比较交叉引物等温扩增法、实时荧光PCR法、环介导等温扩增法的检测灵敏度；通过实际样品检测，以常规培养生化鉴定为基准方法，进行灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确度等5方面比较分析。DNA灵敏度检测显示实时荧光PCR法最灵敏，检测低限在0.9 fg/test；样品添菌实验，3种方法检测低限均可达100 cfu/100 g；与基准方法比较，3种方法灵敏度均达到100 %，假阴性率0%，特异性在98.8%~99.0%之间，假阳性率1.0%~1.2%之间，相对准确度98.8 %~99.0 %之间，均能满足食品实验室检测要求。3种分子生物学方法检测时间短，同基准方法比较，检测结果大致相符，无漏检情况，有假阳性结果，可用于日常阪崎克罗诺杆菌初筛检测。

关键词：乳粉；阪崎克罗诺杆菌；交叉引物等温扩增；比较

阪崎克罗诺杆菌是一种新出现食源性条件致病菌。1961年，Urmenyi等首次报道了两例由该菌引起的脑膜炎病例[1]，根据Urmenyi等[2-3]对新生儿死亡病例研究，明确这种病原菌为“非典型的产黄色色素的阴沟肠杆菌”（yellow-pigmented Enterobacter cloacae）。1980年，该菌被正式定义和分类为肠杆菌科、肠杆菌属的1个种，即阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），由16个生物型组成[4-5]。2008年，Iversen等提议将阪崎肠杆菌生物型划分为1个新的属，即克罗诺杆菌（Cronobacter spp.），包括5个新种（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）和1个克罗诺杆菌基因种[6-7]，2012年，Strydom 等[7]又将该属下原来的种进行重新归类，并命名了两个新种。该属典型种为阪崎克罗诺杆菌。

克罗诺杆菌分布广泛，在婴幼儿乳粉、奶酪、腌肉、水、大米、面包、茶叶、调味料及豆腐等多种食品中均被检测到，而婴幼儿乳粉是婴幼儿患病的主要感染渠道，该菌是新生儿脑膜炎、脓毒血症、小肠坏死性结肠炎的主要病原菌之一，致死率高达40 %~80 %[8]。近些年，随着国内外一系列与该菌相关重大污染事件和奶粉召回事件的爆发，婴幼儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染问题受到全世界的普遍关注，建立准确快速的检测方法已成为国际上对克罗诺杆菌研究的主要内容之一。

目前，国内外对于阪崎克罗诺杆菌的检测方法主要有常规生化检测方法和实时荧光PCR法、环介导恒温扩增法、交叉引物等温扩增等分子生物学方法。其中常规生化培养法为食品中阪崎克罗诺杆菌的检测金标准，也是目前基层实验室检测的主要方式，主要有美国FDA《婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测（2002年修订方法）》及由此修改采用的国家标准GB 4789.40-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》、行业标准SN/T 1632.1-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第1部分：分离与计数》，但是工作量大、耗时长，不适应于快速增长的检测需求；随着分子生物学技术的快速发展及对阪崎克罗诺杆菌全基因序列的研究，实时荧光PCR法[9-10]、环介导恒温扩增法（LAMP）[11-12]、交叉引物等温扩增（CPA）等[13-14]方法逐步建立，并形成相应的行业标准，应用在食品、乳品质量监控领域。

本文旨在通过比较已成熟的实时荧光PCR法、环介导等温扩增方法及交叉引物等温扩增法检测灵敏度，及在实际检测工作中的应用，探求适应于各层次食品微生物实验室检验要求的阪崎克罗诺杆菌快速准确的检测方法，为进一步完善优化阪崎克罗诺杆菌等致病菌的检测体系提供一定的参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤：北京陆桥技术有限责任公司；阪崎克罗诺杆菌检测显色培养基：OXIOD公司；脑心浸液（BHI）：生物梅里埃bioMérieux；营养肉汤：北京陆桥技术有限责任公司；Wizard Genomic DNA Purification Kit：Promega；TaKaRa Premix Ex Taq：Perfect Real Time，大连宝生物；dNTPs：Fermentas；10×Bst buffer；Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；MgSO4、betaine：Sigma；核酸快速检测试纸条：杭州优思达公司。

1.1.2试验用菌株

阪崎克罗诺杆菌：ATCC29544。

1.1.3检测引物

实时荧光PCR方法、LAMP法及CPA方法所需引物及探针详见表1。

表1引物及探针序列Table 1 The sequence of primes and probes

1.1.4检测用样品

采集进口乳粉410份，来源于美国、澳大利亚、新西兰、加拿大等8个国家，其中婴幼儿配方乳粉280份、全脂乳粉50份、脱脂乳粉50份、乳清粉30份。

1.2主要仪器设备

ABI7500荧光PCR仪：美国ABI公司；电泳仪：北京市六一仪器厂；T2A凝胶成像仪、PTC-200PCR仪：美国Bio-Rad公司；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；5417R台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1反应体系及条件

1.3.1.1 CPA法

反应体系：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.8 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8 U/μL BstDNA pol 1 μL，20 μmol/L DF/DR 0.1 μL/ 0.1 μL，10 μmol/L CF/CR 0.8 μL/0.8 μL，20 μmol/L DR/ DF 0.8 μL/0.8 μL，模板1 μL，ddH2O补足至50 μL。

反应条件：63℃反应60 min。

1.3.1.2实时荧光PCR方法

反应体系：2×Premix Ex Taq12.5 μL，10 μmol/L SakaF/R0.5 μL/0.5 μL，3 μmol/L Probe1 μL，模板1 μL，ddH2O补足至25 μL。

反应条件：95℃10s；95℃5s，62℃20s，40个循环。

1.3.1.3 LAMP法

反应体系：10×buffer 2.5 μL，10 μmol/L外引物0.5 μL/0.5 μL，10 μmol/L检测引物4 μL/4 μL，8 U/μL BstDNA pol 1 μL，10 mmol/L Dntp 4 μL，模板1 μL，dd H2O补足至25 μL。

反应条件：60℃反应90 min，4℃保存。

1.3.2灵敏度检测

1.3.2.1 DNA灵敏度检测

阪崎克罗诺杆菌ATCC29544为实验菌株，接种于10 mL营养肉汤中，37℃培养16 h。取1 mL用于细菌基因组提取，利用紫外分光光度计检测DNA质量及纯度。用TE对DNA原液进行10倍梯度稀释至10-8，按照1.3.1反应体系进行实验。

1.3.2.2样品添菌实验

取经证实不含阪崎克罗诺杆菌的乳粉样品A、B 各100 g溶于900 mL MLST中，在增菌前分别添加101 CFU及100数量级阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544，混匀，44℃培养24 h，取0.2 mL MLST增菌液加到5 mL BHI中37℃水浴4 h，待测。每份添加做2个平行，取添加样品未添加菌的样品A、B作为空白对照，同时做细菌计数。

1.3.3实际样品检测

用1.3.1中检测方法体系及现有国家标准方法GB 4789.40-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》（作为基准方法）[15]对来源于不同国家的410份乳粉样品进行检测，对阴、阳性结果进行统计学分析。

2结果与分析

2.1灵敏度实验

DNA灵敏度检测，结果显示ATCC29544纯度为1.736，质量89.73 μg/mL。3种分子生物学方法，DNA灵敏度检测，荧光PCR法检测低限每检测体系有0.9 fg DNA，优于LAMP法、CPA法，高出1~2个数量级，结果见表2。

表2阪崎克罗诺杆菌DNA检测灵敏度比较Table 2 Comparison of the DNA detection sensitivity in Cronobacter sakazakii

添菌增菌实验，结果显示样品空白对照其细菌计数为2.3×102CFU/25 g，且未检出阪崎克罗诺杆菌。当样品中添菌量为3.6 CFU/100 g及36 CFU/100 g时，增菌后，3种方法均可检出，所以经过增菌步骤后，上述3种方法在有干扰菌存在的情况下检测低限均为100 cfu/100 g，满足食品实验室致病菌检测要求，结果见表3。

表3添菌增菌实验结果比较Table 3 Comparison of the add & enrichment bacteria experimental results

2.2实际样品检测

由于快检方法采用与国标基准方法一致的增菌方法，增菌后，基准方法将培养液划线接种于阪崎克罗诺杆菌显色培养基中培养观察，3种快检方法取增菌液进行DNA提取，扩增鉴定。按照ISO定义，快检方法与基准方法属于成对方法，将每种快检方法和基准方法针对每种食品类型得到的检验结果进行比较，并进行灵敏度、特异性、假阳性、假阴性及相对准确度5个参数的计算，检测结果及性能指标见表4。

表4性能指标结果Table 4 Reslut of the performance

通过实验室对每种快检方法与基准方法比较，实时荧光PCR方法、CPA方法、LAMP方法χ2值均小于3.84，表示3种快检方法与基准方法的阳性确证比率在5 %的置信区间内，没有统计学差异。

3种方法的灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率及相对准确度等性能指标均符合ISO提出的标准：灵敏度≥98 %、特异性≥90.4 %、假阴性率<2 %、假阳性率<9.6 %、相对准确度≥94 %，能够满足定性微生物方法的确认要求。

3　讨论

阪崎克罗诺杆菌3种快速检测方法已经成熟，并应用在食品微生物检测领域。本实验旨在着重对该3种方法灵敏度及在实际检测应用中进行比较，总体评价见表5。

表5 3种方法优缺点比较Table 5 Comparison of the advantages & disadvantages of the three methods

总体而言，3种快检方法中，实时荧光PCR方法灵敏度最高，CPA次之，LAMP较低，但是在食源性致病菌的分子生物学实际检测工作中，由于食品中含有食源性致病菌的几率较低，含量较少，食品基质复杂等原因，需要经过增菌后再对增菌液进行DNA提取和检测工作，所以3种快检方法在实际检测工作中灵敏度视为等效。

通过对大量实际样品与国标方法同时进行检测，结果显示3种方法没有漏检的可能性，但会有假阳性结果，分析假阳性发生原因，可能是由于（1）致病菌在食品中已经死亡，但由于是对核酸检测，所以检测阳性，但是用常规培养方法不能培养出致病菌；（2）CPA 和LAMP方法原理可能由于多对引物相互反应，出现引物二聚体导致假阳性结果。

综上所述，实时荧光PCR检测方法，由于其高通量、灵敏度高、检测时间短、避免PCR产物污染等优点，适用于仪器设备、人员素质较高的实验室应用；而CPA和LAMP方法，不需昂贵仪器，检测灵敏度也可达到实际检测需求，可以用于基层及偏远经济不发达地区对食源性致病菌进行快速初筛工作。同时由于交叉引物等温扩增免疫金标法，是以环介导等温扩增技术为基础的新型扩增法，引物设计原理不尽相同，灵敏度高于LAMP检测方法；结果观察利用核酸快速检测试纸条检测扩增结果，避免了LAMP使用肉眼观察沉淀或颜色变化的主观性，整体操作较LAMP更简单快捷，便于实验室人员操作，保护环境不受PCR产物气溶胶污染，避免二次污染。

参考文献：

[1]朱永红.奶粉中阪崎肠杆菌检测方法研究进展[J].中国乳品工业, 2005,33(12):39-43

[2] Urmenyi A M,Franklin A W.Neonatal death from pigmented coliform infection[J].Lancet,1961,277(7172):313-315

[3] Joker R N, Norholm T, Siboni K E. A case of neonatal meningitis caused by a yellow enterobacter[J].Dan Med Bull,1965,12(5):128-130

[4] Farmer J J I, Asbury M A, Hickman-Brenner F W, et al. Enterobacter sakazakii: a new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens[J]. Int J Syst Eyol Microbiol,1980,30:569-584

[5] IVERSEN C,WADDINGTON M,FARMER J J,et al.The biochemical differentiation of Enterobacter sakazakii genotypes[J].BMC Microbiol,2006(6):94

[6] Iversen C,Mullane N,McCardell B,et al.Cronobacter gen. nov.,a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii,and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov.,comb. nov.,Cronobacter malonaticus sp. nov.,Cronobacterturicensis sp. nov.,Cronobactermuytjensii sp. nov.,Cronobacter dublinensis sp. nov.,Cronobacter genomospecies 1,and of three subspecies,Cronobacter dublinensis subsp.dublinensis subsp. nov.,Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp. nov. and Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov[J].Int J Syst Evol Microbiol.2008,58(6):1442-1447

[7] STRYDOM A,CAWTHORN D M,CAMERON M,et al. Species of Cronobacter: a review of recentadvances in the genus and their significance in infant formula milk[J].International Dairy Journal,2012, 27(1/2):3-12

[8]懂晓晖,吴清平,莫树平,等.克罗诺杆菌检测方法研究进展[J].华中农业大学学报,2013,32(1):130-136

[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1632.3-2013出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法[S].北京:中国标准出版,2013:1-5

[10]黄焘,周蒂,王莉萍.阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究[J].环境与职业医学,2013,30(11): 875-879

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 2754.15-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第15部分:阪崎肠杆菌[S].北京:中国标准出版,2011:1-6

[12]董鑫悦,满朝新,卢雁,等.环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌[J].食品工业科技,2013,34(5):318-321

[13]张霞,吴冬雪,曲鹏,等.一种新的等温扩增技术检测阪崎肠杆菌[J].食品科学,2013,34(2):187-190

[14] Zhao Y,Zhang X,Zhang H,et al.Rapid and sensitive detection of Enterobacter sakazakii by cross-priming amplification combined with immuno-blotting analysis[J]. Molecular and Cellular Probes, 2010, 24(6):396-400

[15]中华人民共和国卫生部.GB 4789.40-2010食品国家安全标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验[S].北京:中国标准出版,2010: 1-10

Comparative Study on Rapid Detection Methods of Cronobacter Sakazakii in Milk Powder

WANG Song1，2，ZHANG Xia1，2，WANG Wei2，LI Li3，ZHU Zhen-yuan1，*
（1. Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2. Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456，China；3. Qinghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xining 810099，Qinghai，China）

Abstract：Analyze several widely-applied molecular biological detection techniques of Cronobacter sakazakii，to find the rapid and exact detection method of Cronobacter sakazakii that will meet the food laboratory testing requirements. Compare the detection sensitivity of the methods like cross priming amplification method（CPA），real-time fluorescent PCR method，loop-mediated isothermal amplification method（LAMP）by the DNA detection sensitivity and sample added bacteria experiment；through the sample testing，compare the sensitivity，specificity，false positive rate，false negative rate and the relative accuracy based on conventional cultivation and biochemical identification method. DNA detection sensitivity showed real-time fluorescent PCR method was the most sensitive，low detection limit was 0.9 fg/test；in the sample add bacteria experiment，three methods to detect the low limit of up to 100 cfu/100 g；sensitivity compared with reference methods，three methods were 100 %，false negative rate of 0 %，the specificity was 98.8 %-99.0 %，false positive rate was 1.0 %-1.2 %，relative accuracy of 98.8 %-99.0 %，all of which can meet the demand of food laboratory testing. Compared to the benchmark method，the testing time of three kinds of molecular biology method testing was shorter，the test results were nearly accordance with the traditional standard detection method，no false negative happened，false positive hardly happened. It presented that the three methods can be used for daily Cronobacter sakazakii early screening test.

Key words：milk powder；Cronobacter sakazakii；cross priming isothermal amplification；compare

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.037

*通信作者：朱振元（1969—），男（汉），教授，博士，主要从事糖化学及糖生化学、生物资源与功能食品研究。

作者简介：王淞（1985—），男（汉），工程师，本科，主要从事食品、化妆品检测及实验室管理工作。