P&T- GC- CVAFS法测定海产动物中的甲基汞和乙基汞

崔颖，肖亚兵，王禹，高健会（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461）



P&T- GC- CVAFS法测定海产动物中的甲基汞和乙基汞

崔颖，肖亚兵，王禹，高健会
（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461）

摘要：海产动物样品经过30 %硝酸溶液提取，用2 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液调节pH后，用吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱仪联用系统测定其中的甲基汞和乙基汞的含量。使用衍生试剂，将甲基汞转化为甲基丙基汞，乙基汞转化为乙基丙基汞，吹扫捕集进行富集并进一步消除基体干扰。以空白样品为基体，添加3种浓度水平的甲基汞和乙基汞标准溶液，测得甲基汞的回收率为80.5%~103.2%，相对标准偏差（n=6）为1.7%~6.9%；乙基汞的回收率在84.2%~103.7%，相对标准偏差（n=6）为2.3%~7.0%。

关键词：吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱法；甲基汞；乙基汞；海产动物

海产动物安全检测发展趋势要求准确的定性和定量元素的化学形态，而不仅仅是元素总量的测定。一般意义上所讲的元素形态泛指化学形态，同一元素可能含有多种形态，汞的形态包括元素汞（汞蒸气和液态汞）、无机汞（如氯化汞）以及有机汞（如甲基汞和乙基汞）[1]，汞化合物的毒性依赖于其浓度及其不同的化学形态。烷基汞的毒性比芳基汞和无机汞都大。而烷基汞中又以甲基汞的毒性最大。因此，各国针对海产动物中的甲基汞含量都有严格的限量标准：食品法典委员会（CAC）限定鱼类产品中甲基汞的含量为0.5 mg/kg；我国限定水产动物及其制品中甲基汞含量≤0.5 mg/kg。粮农组织/世卫组织食品添加剂委员会于2003年建立的每周最大摄入量，甲基汞可以摄入1.6 μg/kg（体重）。

海产动物是人类最基本的甲基汞污染来源[2]。汞在水生系统很容易被水生生物吸收，导致鱼类甲基汞的积累。最终，即使在低浓度的甲基汞在水里，它还会引起鱼类产生高水平的汞污染。鱼或其他类型的海鲜，主要是以甲基汞的形式被身体吸收，并且鱼中72 %~ 100 %的汞是甲基汞。口腔接触、中枢神经系统是最重要的靶器官，特别是在婴儿发展的初级阶段。这些毒性作用使一些感官功能（视觉、听觉），运动协调、记忆力、注意力和学习能力变化。

国内对甲基汞的检测方法的研究起步较晚，目前，甲基汞和乙基汞的分析方法主要有：分光光度法、化学滴定法和液相色谱与高灵敏度检测器的联用技术，高灵敏度检测器包括原子荧光光谱法（LC-AFS）、原子吸收光谱法（AAS）、电化学（ECD）、原子发射光谱法（ICP-OES）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[4-7]。化学滴定法成本低廉，但包含更多的人为因素，灵敏度较低。同时，在这种方法中使用的试剂是有毒的，如氯仿、四氯化碳。比色法成本低，但灵敏度低，对复杂样品干扰较大。ICP-MS和LC-AFS具有高灵敏度，分离效果好，但由于其价格昂贵，仪器操作复杂，对使用人员技术水平要求高，不适用于大范围推广，限制了它在日常检测的应用。本文采用吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱仪法，干扰少、灵敏度高、选择性好、线性范围宽、检出限低、速度快、设备运行成本低和易操作等优势，可用来分析甲基汞和乙基汞。

1材料与方法

MERX-M型全自动烷基汞分析仪（吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱仪联用系统：美国BROOKS RAND公司；MaxiMix型旋涡混合器：美国Thermo Scientific公司；GM200型碾磨仪：德国Retsch公司；ULTRA-TURRAX T25型均质机：德国IKA-WERKE公司；KS4000型加热振荡器：美国IKA公司；3-30K型高速冷冻离心机：德国Sigma公司；Dispnsette型瓶口分配器：德国Brand公司；移液器：德国Eppendorf公司；Milli-Q型超纯水仪：美国Millipore公司。

硝酸、盐酸、醋酸：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲基汞、乙基汞标准溶液（纯度99.7 %，浓度1 mg/L）：美国BROOKS RAND公司；丙基化试剂：配制2 %氢氧化钾水溶液，在0℃冰箱中冻至溶液出现冰晶，加入1 g四丙基硼化钠（NaBPr4）粉末，盖紧混合，分装到小瓶中冷冻；2 mol/L醋酸钠-醋酸（NaAc-HAc）缓冲溶液；鱼肉中总汞与甲基汞成分分析标准物质：GBW10029，GSB-20，中国计量科学研究院。

1.2仪器条件

全自动烷基汞分析仪（吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱仪联用系统）条件如表1所示。

表1仪器条件Table 1 Instrument condition

1.3试验方法

1.3.1标准曲线的配制

采用称量法，用0.5 %醋酸-0.2 %盐酸混合溶液配制甲基汞和乙基汞二级标准溶液，浓度分别为10、1、0.1、0.01 pg/μL；将40 mL样品瓶中加水至瓶颈处，各加入300 μL NaAc-HAc缓冲溶液，再加入一定体积的二级标准溶液，使瓶中的甲基汞和乙基汞质量分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1 000 pg，分别加入50 μL丙基化试剂，加超纯水至满，盖紧混匀。

(1)根据直流系统接地报警，关键是尽快查出接地性质与接地支路。正常运行时，正极对地电压为110V，负极对地电压为-110V。当发生单点非金属性接地时，相应正极或负极对地电压降减少，另一负极或正极对地电压升高，例如：当正极对地发生单点非金属性接地时，则U+﹤110V、U-﹥110V，据此，判断故障性质为正极单点接地。当发生单点金属性接地时，相应正极或负极对地电压为零，另一负极或正极对地电压为220V，例如：当正极对地发生单点金属性接地时，则U+=0V、U-=-220V，据此，判断故障性质为正极单点接地。

1.3.2样品处理

海鱼、海虾、贝类等海产动物，取可以食用部位绞碎、匀浆。

1.3.3样品测定

称取0.1 g（精确到0.001 g）样品到20 mL离心管中，加入10 mL 30 %（体积比）硝酸溶液，盖紧，置于60℃振荡器上消解12 h，用超纯水定容至20 mL，混匀。将40 mL样品瓶中加水至瓶颈处，先加入300 μL NaAc-HAc缓冲溶液，再准确吸取1 mL样品液进行分析，加入50 μL丙基化试剂，加超纯水至满后盖紧混匀。将衍生好的样品置于吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱仪联用系统中测定。

2结果与讨论

2.1提取方式的选择

生物样品中有机汞化合物的提取方法主要有酸提取法和碱消解法[10-11]。碱法解法一般采用KOH/甲醇混合溶液作为消解液，并不仅仅萃取甲基汞，也有可能存在其它干扰成分。如果需要更低方法检出限，或进一步的分离出甲基汞，必须对消解过的甲醇样品进行蒸馏，而且碱法会导致消解液中出现过多的泡沫。酸提取时不同形态汞之间的转化率低于碱消解法[12]，因此试验选择超声辅助下的酸提取方法。

2.2提取条件的优化

采用标准参考物质（GBW10029）作质控样品，称取0.100 g质控样，加标1 μg/kg的乙基汞，选用10.0 mL浓度分别为10 %~50 %（体积比）硝酸溶液进行甲基汞和乙基汞的添加回收率实验。在HNO3溶液浓度在30 %时的添加回收率达到最大，与文献报道结果相一致[13-14]。

采用标准参考物质（GBW10029）作质控样品，称取0.100 g质控样，加标1 μg/kg的乙基汞，碱法提取9 h~ 14 h，来进行甲基汞和乙基汞的添加回收率实验。提取时间为10 h时，甲基汞的提取率为88 %，乙基汞的提取率为95 %。考虑到工作效率和操作的方便性，最终选择提取1次。

2.3衍生试剂的选择

采用气相色谱技术进行汞形态分离之前，通常需要对提取预富集后的样品进行衍生化处理[3]，将非挥发性的离子态甲基汞和乙基汞转化为挥发态的烷基甲基汞和烷基乙基汞，常用的衍生试剂主要有硼酸钠、四乙基硼化钠[15-17]、四丙基硼化钠和四苯基硼化钠[18-19]，其中，四乙基硼化钠最为常用，但不能区分Hg（Ⅱ）和乙基汞，因为两者的衍生产物都是二乙基汞，为此发展了四丙基硼钠，它们均在弱酸性条件下（pH4.0~4.5）进行衍生。有报道[20]比较了以上3种衍生剂，结果表明，与四丙基硼化钠相比，四苯基硼化钠作为衍生试剂，衍生反应效率低，产物的挥发性较差。综合以上因素，四丙基硼化钠衍生化后产物的峰响应值更高、色谱峰形更好、保留时间更长，可避免早洗脱的基质成分的干扰。同时考虑到四乙基硼化钠生成的衍生产物分子量更大，吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱检测时可避免低分子量杂质的干扰，具有更高的灵敏度和选择性，因此采用四丙基硼化钠作为衍生试剂。

2.4衍生条件的优化

对衍生反应的条件进行优化，结果显示2 mol/L NaAc溶液中加入0.3 mL HAc以调节pH后，甲基汞和乙基汞的色谱峰响应值最高，回收率最高，此时pH= 4.5。如图1所示。

图1 pH对回收率的影响Fig.1 Effect of pH to recovery（n=2）

四丙基硼化钠的加入直接影响丙基化产物的量，考察了四丙基硼化钠为30、40、50、60、70、80 μL对回收率的影响。过多四丙基硼化钠的加入反而使回收率变低，这可能是因为过多的衍生试剂导致丙基化反应过快[21]。为确保高浓度的甲基汞和乙基汞能被完全衍生，同时节省四丙基硼化钠，本研究采用50 μL的四丙基硼化钠进行试验，如图2所示。

图2四丙基硼化钠的加入量对回收率的影响Fig.2 Effect of addition of NaBPr4to recovery（n=2）

2.5色谱条件的优化

甲基汞和乙基汞与四丙基硼化钠反应生成了甲基丙基汞（MeHgPr）和乙基丙基汞（EtHgPr），它们均属弱极性化合物，适合于弱极性的色谱柱分离。在设定的色谱条件下，甲基汞、乙基汞衍生反应产物甲基丙基汞和乙基丙基汞能完全实现的基线分离。

2.6标准曲线

按照试验方法对甲基汞和乙基汞的混合标准溶液进行测定，标准溶液系列进行衍生后测定，分别将甲基汞和乙基汞衍生产物的峰高对其含量作图建立标准工作曲线，甲基汞和乙基汞的线性范围均为5× 10-3μg/kg~10 μg/kg。曲线方程及相关系数见表2。

表2甲基汞和乙基汞的线性回归方程和相关系数Table 2 Regression equations，correlation coefficients of methylmercury and ethylmercury

2.7方法的精密度和回收试验

分别在空白的海产动物基质（金枪鱼、海虾、海螺）中添加0.25、0.50、1.00 μg/kg 3个浓度水平的甲基汞和乙基汞标准，按优化后的试验方法进行测定，结果见表3。

甲基汞的相对标准偏差为1.7 %~6.9 %，甲基汞的加标回收率在80.5 %~103.2 %之间；乙基汞的相对标准偏差为2.3%~7.0 %，乙基汞的加标回收率在84.2 %~ 103.7 %之间，结果表明该方法对于测定海产动物样品中甲基汞和乙基汞的含量准确可行。

表3甲基汞和乙基汞的加标回收试验和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of methylmercury and ethyrlmercury in samples（n=6）

2.8样品分析

按试验方法对日常进出口的6批金枪鱼、3批三文鱼、3批鲅鱼、2批海虾、2批贝类样品和市售的海螺进行甲基汞和乙基汞含量的测定，海螺的甲基汞和乙基汞的含量为52.4 ng/kg和10.6 ng/kg，其余结果均为阴性。具体结果见表4。

表4样品中甲基汞和乙基汞的含量（n=2）Table 4 Contents of methylmercury and ethylmercury in samples （n=2）

3　结论

本工作以四丙基硼化钠作为衍生试剂，采用吹扫捕集-气相色谱分离-冷蒸汽原子荧光光谱法同时测定了甲基汞和乙基汞，检测时间较短，方法的检出低限可以满足国际上对与海产动物中甲基汞和乙基汞的限量要求。用灵敏的甲基汞和乙基汞检测方法监控海产动物质量具有积极的意义。

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Purge and Trap Gas Chromatography-Cold Vapor Atomic Fluorescence Spectrometry Determination of Methyl Mercury and Ethyl Mercury in Marine Animals

CUI Ying，XIAO Ya-bing，WANG Yu，GAO Jian-hui
（Animal，Plant and Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：Marine animals sample was extracted with 30 % nitric acid solution，and then adjusted the pH with 2mol/Lsodiumacetate-aceticacidbuffersolution.Theeluateobtainedwasdeterminedandidentifiedbypurgeand trap gas chromatography-cold vapor atomic fluorescence spectrometry（P&T-GC-CVAFS）. The propylation derivatization converted Methyl mercury（MeHg）to the more volatile methyl propyl mercury（MeHgPr），Ethyl mercury（EtHg）tothemorevolatileethylpropylmercury（EtHgPr），whichcouldbeconcentratedthroughpurgeand trapsystemwithafurtherclean-upofmatrix.Testsforrecoverywere made by addition of standard MeHg and EtHg solutions at 3 different concentration levels to blank marine animals sample matrixes，values of MeHg recovery foundwereintherangefrom80.5%to103.2%，with RSDs（n=6）intherangefrom1.7%to6.9%；values of EtHg recovery found were in the range from 84.2 % to 103.7 %，with RSDs（n=6）in the range from 2.3 %to7.0%.

Key words：P&T-GC-CVAFS；Methyl mercury；Ethyl mercury；marine animals

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.034

作者简介：崔颖（1986—），女（汉），工程师，本科，研究方向：食品元素及形态检测。

基金项目：天津出入境检验检疫局资助项目（TK077-2013）