响应面法优化酶解提取花生根茎中白藜芦醇

王月珍，汪岩，马千里，刘志红，牛艳秋（长春医学高等专科学校，吉林长春130031）



响应面法优化酶解提取花生根茎中白藜芦醇

王月珍，汪岩，马千里，刘志红，牛艳秋
（长春医学高等专科学校，吉林长春130031）

摘要：对酶解法提取花生根茎中的白藜芦醇工艺进行研究，确定最佳酶解提取工艺。以纤维素酶用量、酶解时间、料液比为自变量，以白藜芦醇提取率为因变量，通过对自变量的不同水平进行多元线性回归及二项式拟合，采用星点设计-响应面法优化白藜芦醇提取工艺，并进行预测分析。结果表明：酶解法提取花生中白藜芦醇的最佳工艺为：纤维素酶用量50mg/g，酶解时间20h，料液比1∶12（g/mL）。

关键词：花生；纤维素酶酶解；星点设计-响应面法；白藜芦醇

花生又称落花生、番果和长寿果，为一年生草本植物，来源于豆科[1]。在我国，花生年产量约12 000 kt[2]高居世界第二。花生多以其种子食用，其根、茎、叶多被废弃在田间地头，或者被作为牲畜的草料和生活柴草，从而造成资源的极大浪费。现代药学研究表明：白藜芦醇在花生根中含量最高，花生茎中次之，其后依次为花生红衣和花生仁[3]，可见花生根、茎是提取白藜芦醇的天然植物资源。

白藜芦醇（Resveratrol，Res）又称芪三酚，是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚类化合物，于1939年首次从毛叶藜芦植物中提取得到，1976年Ingham首次从花生中分离得到该物质。随着研究的深入，发现该成分具有抗癌、抗病毒、抗氧化、抗诱变、保肝、抑菌及降血脂等功效[4]，所以在食品、药品、保健品中的应用广泛，随着市场需求的不断加大，建立一套行之有效的白藜芦醇提取工艺开始被人们所关注。目前，白藜芦醇的提取方法有多种[5]，王凤舞等用纤维素酶酶解法提取花生红衣中白藜芦醇[6]，其中因其高效性而成为该提取工艺的研究重点，虽比传统工艺优越很多，但因纤维素酶的不稳定性及周围环境的复杂性，在进行酶解提取后，白藜芦醇提取率却是千差万别，重复性较差。并且酶解法提取花生根、茎中白藜芦醇鲜见报道，故本研究采用酶解法进行白藜芦醇的提取工艺研究，以花生根、茎为原料，采用星点设计-响应面法优化白藜芦醇的提取工艺，从而建立花生根、茎的白藜芦醇最佳提取工艺，为白藜芦醇的规模化提取及拓宽白藜芦醇提取的植物来源提供科学的参考。

1　材料

Agilent 1100高效液相色谱仪、DAD检测器、Agilent色谱工作站：美国安捷伦；KQ2200E型超声清洗机：中国昆山仪器有限公司；ALC211014电子天平：国华电器有限公司；电热真空干燥箱：上海精宏；WK-4008高速中药粉碎机：青州市精诚机械有限公司。

白藜芦醇对照品：由中国药品生物制品检定所提供（批号111535-200502）；花生（四粒红）根、茎：采自吉林省桦甸市靖宇县，经鉴定为豆科植物落花生属花生的干燥根和茎；纤维素酶（1 000 U/g）：上海紫一试剂厂；提取用乙醇为分析纯，水为蒸馏水；HPLC含量测定用乙腈为色谱纯，水为超纯水；处理供试品和对照品用试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1白藜芦醇的含量测定

2.1.1色谱条件

色谱柱：大连伊利特分析仪器有限公司产4.6 mm× 250 mm，5 μm C18柱；流动相：乙腈-水（40：60，体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：303 nm。2.1.2对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的白藜芦醇对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加适量乙腈定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3供试品溶液制备

称取花生根、茎提取物10 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中加乙腈定容至刻度，超声5 min，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4标准曲线绘制

精密吸取白藜芦醇对照品溶液分别稀释成100、200、300、400、500 μg/mL的溶液，依次进样，按2.1.1项下的色谱条件测定。以浓度（Y）为纵坐标，峰面积（X）为横坐标，绘制标准曲线，并得回归方程：Y= 35.148 X-0.73，r=0.999 7。表明白藜芦醇在100 μg/mL～500 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.5精密度试验

按照“2.1.1”项下的色谱条件试验，取同一浓度的白藜芦醇对照品溶液，连续进样5次，测定峰面积积分值，计算精密度。RSD为2.6 %，表明精密度良好。

2.1.6稳定性试验

取同一样品溶液，分别在0.5、1、4、8、12 h测含量，结果样品在12 h内基本稳定，RSD为2.9 %。

2.1.7重复性试验

精密称取同一批花生根、茎提取物的粉末5份，每份0.1 g，按“2.1.3”项下方法制备和“2.1.1”项下色谱条件进行测定，RSD为3.2 %。

2.1.8加样回收率

精密称取己知白藜芦醇含量的花生提取物粉末5份，每份0.05 g精密加入白藜芦醇储备液0.1 mL，按“2.1.3”项下方法制备和“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。白藜芦醇的平均回收率为99.8 %，RSD为3.2 %。

2.1.9含量测定

按照2.1.3所述方法将试验中各样品制成供试品，分别取过0.45 μm微孔滤膜的各供试液续滤液10 μL注入高效液相色谱仪，测定各组白藜芦醇的含量，计算白藜芦醇提取率。

2.2白藜芦醇提取工艺优化

2.2.1单因素试验

根据报道[7]可知白藜芦醇对光热敏感易分解，会影响其提取率，故在试验时注意保持在室温下避光酶解，选取纤维素酶添加量（10、30、50 mg/g）、酶解时间（6、18、30 h）、料液比[1∶4、1∶8、1∶12（g/mL）]作为考察因素，观察其对花生根茎中白藜芦醇提取率的影响，结果白藜芦醇提取率分别为0.82 %、0.97 %、0.89 %、0.94 %、1.03 %、0.98 %、0.87 %、0.99 %、1.07 %。说明3个因素均为影响白藜芦醇提取率的主要因素。

2.2.2星点设计-响应面法优化工艺

根据2.2.1的试验结果，采用星点设计-响应面法建立试验模型，以主要影响因素为自变量，白藜芦醇提取率为因变量，每个因素设计5个水平，分别为：-α，-1，0，1，α，其中α=1.628。因素水平见表1；试验星点设计及结果见表2。

表1白藜芦醇的提取工艺星点试验因素水平Table 1 The extraction process of resveratrol for factor levels

表2白藜芦醇的提取工艺星点试验安排Table 2 The extraction process of resveratrol for experiment planning

续表2白藜芦醇的提取工艺星点试验安排Continue table 2 The extraction process of resveratrol for experiment planning

根据表2的数据，运用Design-Expert.8.05软件分析响应面，以白藜芦醇提取率（Y）为响应值分别对各因素进行多元线性回归二项式方程拟合，拟合模型为：Y =1.02 +0.13A +8.32B +0.05C +2.50AB +0.02AC + 5.00BC+0.04A2+3.36B2+0.02C2（R2=0.955 0），对模型采用F检验进行方差分析，结果见表3。

表3白藜芦醇提取率星点设计F检验方差分析Table 3 The resveratrol extraction yield design for F test of variance analysis

由方差分析表可知，所选取的因素对白藜芦醇提取率的影响为：A>C>B，即加酶量对提取率的影响最为显著，其次为提取溶剂用量和酶解时间。提取率与提取各因素之间关系见图1。

运用Design-Expert.8.05软件对二项式回归模型进行预测分析，得到的白藜芦醇最佳提取工艺为：酶添加量50 mg/g，酶解时间30 h，料液比1∶12（g/mL），此时预测得到白藜芦醇的提取率为1.28 %。按所得到的最佳工艺进行3次验证性试验，结果显示白藜芦醇的提取率平均值为1.25 %，与预测值的偏差为0.03 %，且试验重现性较好。但考虑实际的操作性，建议对影响因素较小的酶解时间进行合理控制，最后确定最佳提取工艺为：酶添加量50 mg/g，酶解时间20 h，料液比1∶12（g/mL）。

图1各因素对花生根、茎白藜芦醇提取率的影响Fig.1 The factors of the effects that extraction yield of resveratrol from the root and stalk of the peanut注：a为酶添加量与料液比的交互作用；b为酶添加量与酶解时间的交互作用；c为酶解时间与料液比的交互作用。

3　讨论

1）研究结果表明，优化后的工艺条件明显改善了原有的酶解法所存在的提取率不稳定、提取时间不确定及提取剂浪费等问题，优化后的提取工艺使提取率保持在1.25 %以上，且提取效果稳定，重现性好，避免了试剂与提取时间的浪费。

2）试验过程中避光和室温的选择也为以后花生根、茎中的白藜芦醇的工业规模化提取提供了一定的现实数据支撑，保证了工艺实施推广的可行性。

3）目前，我国白藜芦醇的提取原料主要来自于葡萄、虎杖等植物。花生根、茎中白藜芦醇提取工艺的建立扩大了白藜芦醇提取原料的取材范围，使花生植物物尽其用，提升了花生植物资源的经济价值，为农民创收的同时避免了资源的严重浪费，减少了农作物秸秆的季节性燃烧，为进一步提升空气质量起到了一定的积极作用。

参考文献：

[1]姜燕,鲍慧娟,张海悦.花生红衣白藜芦醇的研究进展[J].食品研究与开发,2013,34(18):129-132

[2]赵海峰,魏强,于秀妍.我国花生生产现状及增产措施[J].农业科技与装备,2009(2):81-82

[3]张烜,胡君萍,韩玫,等.HPLC法测定花生不同部位中白藜芦醇的含量[J].新疆医科大学学报,2003,26(5):440-441

[4]程建蕊,王振月,胡凤,等.白藜芦醇在植物中的分布及其生物活性研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化,2007,9(5):91-96

[5]王琴飞,李景明,张如莲.花生中白藜芦醇及其衍生物的研究进展[J].中国粮油学报,2009,24(10):145-152

[6]王凤舞,李鹏,朴美子.纤维素酶法提取花生红衣中的白藜芦醇[J].中国食品学报,2009,9(5):76-80

[7]曹庸,于华忠,张敏,等.HPLC法测定虎杖白藜芦醇的含量及其稳定性研究[J].林产化学与工业,2004,24(2):61-64

Optimize for Enzymatic Hydrolysis Extraction of Resveratrol from Peanut Rhizoma by Central Composite Design and Response Surface Methodology

WANG Yue-zhen，WANG Yan，MA Qian-li，LIU Zhi-hong，NIU Yan-qiu
（Changchun Medical Collage，Changchun 130031，Jilin，China）

Abstract：To make sure the best enzymolysis extraction process，enzymatic hydrolysis extraction of resveratrol from peanut rhizoma was investigated. Taking cellulose dosage，emzymolysis time and solid-liquid ratio as independent variables，overall extraction of resveratrol from peanut rhizoma as dependent variable，each level of

independent variables was fitted by multiple linear regression and binomial formula fitting，extraction prosess was optimized by response surface method，and prediction was carried out through comparing the observed and predicted value.The results showed that the optimum conditions for enzymolysis were：cellulose dosage 50 mg/g，20 h for enzymolysis and solid-liquid ratio 1∶12（g/mL）.

Key words：peanut；cellulose degradation；CCD；resveratrol

收稿日期：2015-09-11

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.031

作者简介：王月珍（1978—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：中药学、药用资源质量评价。