响应面法研究β-环糊精微波协同提取甘草黄酮的工艺研究

任光明，葛雪琴（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）



响应面法研究β-环糊精微波协同提取甘草黄酮的工艺研究

任光明，葛雪琴
（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

摘要：用β-CD微波协同提取甘草中的黄酮，在单因素试验基础上采用响应面（RSM）分析法，考察β-CD用量、微波功率、料液比、微波时间、乙醇体积分数、对黄酮提取率的影响。单因素试验确定最佳提取条件为：甘草∶β-CD（质量比）为1∶0.8、微波功率200 W、料液比1∶30（g/mL）、微波提取时间150 s、乙醇体积分数60 %；响应面法试验优化结果为：微波功率200 W、微波提取时间145s、料液比1∶32（g/mL）。

关键词：甘草；黄酮；微波提取；响应面法

甘草又名粉草、蜜草、甜草等，属植物的干燥根，甘草味干、平，性温、微凉，无毒。药用价值历史悠久[1]，功能主治清热解毒，祛痰止咳、益气补中等。在中草药中具有众药之王的美誉。其主要成分有甘草酸、甘草黄酮类、甘草多糖类化合物。随着现代医学对甘草研究的深入，发现甘草中黄酮类物质有抗炎、抗病毒、强心、镇静和镇痛作用；后又发现它们能抗氧化、抗衰老、抗肿瘤。另外，甘草黄酮对糖尿病和肥胖也有一定预防作用[2]。甘草主要生长在法国、意大利、西班牙、伊拉克、伊朗、前苏联各加盟共和国以及中国[3]。

环糊精（CD）具有疏水性的内腔和亲水性的表面，是超分子化学中的基础物质之一，它具有的包合特性使其在理论和实际应用中得到迅速发展[4]。尤其在医药方面，CD和CD衍生物与传统药物载体材料相比，无毒，性质稳定，结构独特，可用于提高药物溶解度和稳定性，增强药物利用率[5]。这样，方法简便，效果明显，便于工艺加工。

目前已有多种方法用于提取和测定黄酮，其中微波辅助提取就是一种快速有效的方法。微波辅助提取，又称微波萃取，Microwave Extraction（ME）或Microwave Assisted Extraction（MAE），它是微波和传统的溶剂萃取法相结合后形成的一种新的萃取方法[6]。由于微波有很强的穿透性、高的加热效率和破碎植物细胞壁的能力，这样不仅提高了提取效率，缩短了提取时间，还能大大节约能源。另一方面微波的快速高温处理可以将细胞内某些降解有效成分的酶灭活，从而使这些有效成分在药材保存或提取时间内不会遭到破坏。所以微波萃取法具有萃取时间短，溶剂用量少，提取率高，溶剂回收率高，所得产品品质好，成本低，投资少等优点，广泛用于食品、化学合成、分析、环保等领域[7]。本文选取了β-CD为提取介质，采用单因素和响应面法试验确定了微波辅助提取黄酮的优化条件，直接用可见分光光度法测定其含量，并为提取黄酮的工业生产提供了重要的试验依据。

1材料与方法

1.1仪器和材料

1.1.1仪器

LWMC-201型可调功率微波化学反应器：南京陵江科技开发公司；725可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.1.2原料

甘草：由忻州惠康药店提供，粉碎，过筛，装瓶待用。

1.1.3试剂

亚硝酸钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市申泰化学试剂有限公司；硝酸铝（分析纯）、β-环糊精（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；试验所用其他试剂为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.2试验方法

1.2.1微波萃取法

准确称量1.000 0 g的已粉碎的甘草和0.800 0 g β-CD加入100 mL的圆底烧瓶中，加入30mL的60 %乙醇，放入微波炉，在微波功率为200 W，辐射累计达150 s后，将提取液冷却过滤，除去物料后将所得滤液用60 %乙醇定容到50 mL容量瓶刻度处。

1.2.2总黄酮的测定方法

用移液管吸取2 mL黄酮提取液于10 mL的比色管中，加5 %亚硝酸钠溶液0.2 mL，摇匀后放置6 min，加10 %硝酸铝溶液0.2 mL，摇匀后放置6 min，加4 %氢氧化钠溶液2.0 mL，再用60 %氢氧化钠的乙醇溶液定容，摇匀后放置15 min。在最大吸收峰510 nm波长处测定其吸光度，计算黄酮的含量。

甘草总黄酮得率的计算公式：

甘草总黄酮得率/%=（滤液中黄酮含量/所用甘草重）×100[8]

1.2.3响应面法（response surface methodology，RSM）

采用多元二次回归方程拟合与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求工艺函数，解决多变量问题的一种统计方法[9]。

2结果与讨论

2.1标准曲线的绘制

称取芦丁标准品15.00 mg置于50 mL的容量瓶中，加入60 %的乙醇使之溶解，再加入60 %的乙醇定容至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液，每1 mL含无水芦丁0.300 0 mg。吸取芦丁标准溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分别置于10 mL比色管中，加5 %亚硝酸钠溶液0.2 mL，摇匀后放置6 min，加10 %硝酸铝溶液0.2 mL，摇匀后放置6min，加4%氢氧化钠溶液2.0mL，再加入60 %的乙醇定容至刻度，摇匀，后放置15 min。在最大吸收峰510 nm波长处测定其吸光度[10]，所得数据经回归处理，得回归方程为：Y=9.926 4X + 0.016 5，式中：X为被测样中黄酮的质量；Y为吸光度，相关系数R2=0.999 2。

2.2单因素试验

2.2.1不同介质对甘草中黄酮得率的影响

称取处理好的1.000 0 g已粉碎的甘草3份分别置于3个100 mL圆底烧瓶中。分别加入30 mL 60 %乙醇、0.800 0 g β-CD、0.800 0 g HP-β-CD，按1.2.1的方法提取，在510 nm处测定其吸光度。计算黄酮的含量（见表1）。

表1不同介质中黄酮的得率Table 1 The flavonoids extraction rate of different medium

由表1知，微波辅助β-CD提取甘草中黄酮效果最佳。

2.2.2 β-CD用量对得率的影响

准确称量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它条件不变，只改变β-CD用量，甘草β-CD（质量比）为1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1，按1.2.1节方法提取并在510 nm处测定其吸光度，计算黄酮的含量，见图1。

从图1可以看出，随着β-CD用量的增加，得率有明显增加。但当增加至0.8000 g后，再增加β-CD用量，得率没有进一步增大，故选择最佳β-CD用量为0.800 0 g。

图1 β-CD用量对得率的影响Fig.1 Effect of β- cyclodextrin amount on the yield

2.2.3微波功率对得率的影响

准确称量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它条件不变，只改变微波功率为（160、200、240、280、320 W）按1.2.1的方法提取并在510 nm处测定其吸光度，计算黄酮的含量，见图2。

图2微波功率对得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on the yield

从图2可看出，微波功率在160 W~200 W内，得率随着微波功率的增大有明显增加。但当微波功率增大到50 %以上时，随着微波功率的增大，得率下降。故选择200 W为最佳微波提取功率。

2.2.4料液比对得率的影响

准确称量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它条件不变，只改变液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/ g）按1.2.1节方法在510 nm处测定其吸光度，计算黄酮的含量得率，见图3。

图3液料比对得率的影响Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the yield

从图3可看出，在料液比为1∶30（g/mL）的条件下，得率达最大值，继续增加料液比，得率明显下降，故选择1∶30（g/mL）为最佳料液比。

2.2.5时间对得率的影响

准确称量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它条件不变，只改变微波辐射时间为（60、90、120、150、180s），按1.2.1节方法在510 nm处测定其吸光度，计算黄酮的含量，见图4。

图4时间对得率的影响Fig.4 Effect of time on the yield

从图4可看出，随着微波辐射时间的增加，得率有明显的增加，但当增至150 s后，得率随着辐射时间的增加而减少，故选择150 s为最佳微波辐射时间。

2.2.6乙醇体积分数对得率的影响

准确称量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它条件不变，只改变乙醇的体积分数为50 %、60 %、70 %、80 %、90 %，按1.2.1节方法在510 nm处测定其吸光度，计算黄酮的含量，见图5。

图5乙醇浓度对得率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield

从图5可看出，乙醇体积分数在40 %~60 %内，得率随着乙醇体积分数的增大有明显增加。但当乙醇体积分数增大到60 %以上时，随着乙醇体积分数的增大，得率下降，在80 %有小幅度上升，但考虑耗能等因素。故选择60 %为最佳乙醇体积分数。

2.3响应曲面优化试验

2.3.1响应曲面设计

在单因素试验的基础上[最优条件为：β-CD用量为0.800 0 g、微波功率200 W、辐射时间150 s、料液比1∶30（g/mL）、乙醇体积分数60 %]，采用Box-Behnken设计方案做响应曲面研究，3个自变量微波功率、提取时间、料液比分别以X1，X2和X3代表，以+1，0，-1分别代表各自的不同水平，编码因素及水平、试验设计方案见表2。

2.3.2模型建立及显著性检验

响应面设计试验中，以微波功率、提取时间、料液比为参数，黄酮得率为响应值，进行三因素三水平响应曲面分析试验。试验结果见表3。

表2响应面法分析因素及水平Table 2 Analytical factors and levels for response surface methodology analysis

表3响应面分析试验方案和结果Table 3 Experiment design and results of response surface methodology

利用Design Expert 7.0.0软件对数据进行二次多元回归拟合，得到黄酮得率（Y）对编码自变量：微波功率（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）之间的二次多项回归方程：

回归方程系数及显著性检查见表4。

表4回归方程系数及显著性检查Table 4 Regression coefficient and significance test

续表4回归方程系数及显著性检查Continue table 4 Regression coefficient and significance test

从表4黄酮得率回归模型方差分析（ANOVA）可以看出：F回=243.599 3，P<0.000 1，表明本试验所选用的二次多项式模型具有高度的显著性与实际试验拟合较好。模型的R2=0.996 8，模型的校正决定系数R2Adj=0.992 7，表明仅有不到0.8 %的黄酮提取率的总变异不能由此模型来解释。同时，由表4可见，一次项中X1，X2显著；交互项中X2X3极显著，二次项中X12，X22，X32极显著。

Design Expert软件中Box-Benhnken法[11]计算甘草中黄酮得率回归模型的调整系数（Adj R-squared）Adj R2=0.996 8，即该模型能解释99.68 %响应值的变化，表示该模型拟合程度良好，且试验误差小，说明响应面法优化甘草中黄酮的提取条件是可行的。

2.3.3响应曲面分析

利用Design Expert 7.0.0软件对表3数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的等高线及响应曲面见图6~图8。

根据二次模型所得到的等高线及响应面可以评价试验因素之间的交互作用程度，以及确定各因素的最佳水平范围。

由图6可知：当料液比为1∶30（g/mL），提取时间不变的条件下，微波功率在160 W~200W范围内增大时，甘草中黄酮得率增加，并在200 W附近达到极大之后降低，与单因素试验结果吻合。提取时间的影响不大，曲面比较平滑。

由图7可知：微波功率、料液比的影响都显著，两个曲面都比较陡。等高线呈圆形，说明两因素作用很强，影响显著[12]。

由图8可知：微波功率固定的条件下，液料比不变的情况下，甘草中黄酮得率受提取时间的影响不太显著，表现为曲面比较平缓，先升高后平缓降低的曲线。

图6微波功率、提取时间的等高线和响应曲面图Fig.6 Contour and response surface plots for the effects of microwave power and extraction time on the yield of flavonoids

图7微波功率、液料比的等高线和响应曲面图Fig.7 Contour and response surface plots for the effects of microwave power and liquid-to-solid on the yield of flavonoids

图8提取时间、液料比的等高线和响应曲面图Fig.8 Contour and response surface plots for the effects of extraction time and liquid-to-solid on the yield of flavonoids

由图6~图8可以看出等高线呈椭圆，说明提取时间和微波功率、微波功率和液料比、液料比和提取时间之间交互影响显著[13]，响应面陡峭说明提取得率对提取时间、微波功率和液料比的变化敏感[8]。

对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即3个因素的最佳水平值，转换后得到提取的最佳条件为甘草∶β-CD（质量比）为1∶0.8，微波功率200 W，提取时间145 s，料液比1∶32（g/mL），此时甘草中黄酮的得率达1.484 %。

2.4模型验证

对试验进行验证，选择的条件为甘草∶β-CD（质量比）为1∶0.8、微波功率200 W、微波提取时间145s、料液比1∶32（g/mL），黄酮得率分别为1.472 %，1.462 %，1.402 %，平均为1.445 %，相对误差为2.6 %，数据重现性良好，偏差不大，吸光度测定值稳定说明每次测定的黄酮含量稳定，说明该结果是合理可靠的。

3结论与展望

本文以甘草为原料，运用现代的微波提取技术，采用可见分光光度计对甘草中黄酮的含量进行了测定，获得结论如下：

在单因素试验的基础上通过响应面法的优化，获得微波辅助β-CD介质提取甘草中黄酮的最佳工艺条件：甘草∶β-CD（质量比）为1∶0.8，微波功率200 W，提取时间145 s，料液比1∶32（g/mL），此时甘草中黄酮的得率达1.484 %。模型经验证后结果稳定，表明响应曲面法更好地反映了各因素对得率的影响，以及因素间的相互作用强度，是一种比较好的优化工艺的方法。

黄酮类化合物是甘草中一类重要的活性成分。在甘草的根、叶中，均含有数量相当可观的黄酮类化合物，具有开发利用价值。如何有效地提取这些化合物成为中药研究的关键技术之一，文中数据为进一步开发和利用黄酮这一自然资源提供了重要的试验依据。

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Research of Microwave and β-Cyclodextrin Coassisted Extraction Licorice Flavonoids by Response Surface Method

REN Guang-ming，GE Xue-qin
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Abstract：On the basis of single factor experiment using the response surface method，microwave-assisted extraction of licorice flavonoids with β-CD as media was investegated. The impact factor，such as the amount of β-CD，microwave power，solid-liquid ratio，microwave time and the concentration of ethanol were determined，the optimum extraction conditions was as follows：the amount of beta-CD 0.800 0 g，microwave power 200 W，solid-liquid ratio 1∶30（g/mL），microwave extraction time 150 s，the concentration of ethanol 60 %；response surface method for experimental optimization results as follows：microwave power 200 W，the microwave extraction time 145 s，the solid-liquid ratio of 1∶32（g/mL）.

Key words：licorice；flavonoids；microwave extraction；response surface method

收稿日期：2014-07-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.027

作者简介：任光明（1963—），男（汉），教授，本科，从事分析化学教学与科研工作。

基金项目：忻州师范学院化学化工创新实践基地（院政字201331）；大学生创新创业训练项目（2013328）