骨肉瘤化疗耐药分子机制的相关研究进展

王雅灵　闵大六

上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科，上海　200030

骨肉瘤化疗耐药分子机制的相关研究进展

王雅灵闵大六#

上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科，上海200030

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤之一，好发于儿童及青少年。术前和术后化疗结合手术治疗是目前骨肉瘤的主要治疗方法。但肿瘤多药耐药是骨肉瘤发生局部复发、远处转移及治疗失败的重要原因。明确骨肉瘤化疗的耐药机制，逆转骨肉瘤耐药，降低骨肉瘤患者复发转移率对临床治疗有重要意义。本文将对骨肉瘤化疗耐药作一综述。

骨肉瘤；多药耐药；耐药分子机制；研究进展

骨肉瘤是常见的骨恶性肿瘤之一，其中以股骨远端和胫骨近端最多见，大约60%的骨肉瘤患者发病年龄为10～20岁［1］，男性多于女性［2］。20世纪70年代，骨肉瘤标准治疗方法是截肢术，术后患者5年生存率低于20%［3］。随着化疗药物的出现和应用，目前骨肉瘤患者的治疗已形成术前新辅助化疗再择期手术，术后行辅助化疗的模式，5年生存率已由20世纪70年代的10%～20%上升至现在的70%～80%［4-5］。骨肉瘤的发生发展是一个异常复杂的过程，是由多种因素共同引起骨组织发生变化，最终导致骨肉瘤的发生。但是无论是原发性骨肉瘤还是转移性骨肉瘤，随着化学治疗的次数增多，患者对常规的化疗药物都会产生耐药，化疗耐药是骨肉瘤患者治疗失败的主要原因。骨肉瘤患者按标准化疗治疗后发生多药耐药而导致化疗疗效不理想仍然是一个尚未解决的问题。

骨肉瘤化疗耐药的发生与多药耐药机制密切相关。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，发生不仅对此种化疗药物耐药，而且可对其他结构和功能不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。这是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的防御机制，也是导致化疗失败的主要原因之一。MDR与多种细胞机制相关，已知的MDR产生机制有：化疗药物在细胞内的有效蓄积量减少，如P糖蛋白（P-gp）的外排泵药机制；机体内药物代谢酶含量或活性以及分布的改变；控制细胞凋亡的相关基因异常，如蛋白激酶C（PKC）介导的耐药机制，凋亡与多药耐药；细胞内与耐药机制相关的某些信号通路改变等，如miR-33a通过TW IST/ET-1级联通路调控骨肉瘤耐药分子。本文主要对近几年骨肉瘤多药耐药的分子机制研究进展进行综述。

1　多药耐药相关蛋白

肿瘤的多药耐药是骨肉瘤化学治疗失败的重要原因。它可以存在化疗之前，患者本身出现耐药，即天然性耐药；也可以存在化疗之后对化疗药物产生耐药，即获得性耐药。肿瘤的多药耐药概念首先由Biedler和Riehm［6］在1970年提出，即肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药的同时，对化学结构和作用机制完全不同的其他抗肿瘤药物也可产生交叉耐药性。

MDR蛋白过表达是耐药相关机制之一。MDR蛋白能将细胞内的药物转运出胞外，从而降低细胞内药物蓄积。研究显示MDR蛋白能够抑制caspase-3和caspase-8活性（促细胞凋亡关键分子），抑制肿瘤化疗药物介导的细胞凋亡。由ABCB1基因编码的P-gp是第一个被发现的MDR蛋白［7］。P-gp是一种相对分子量为170kD的跨膜糖蛋白，它具有能量依赖性“药泵”功能。P-gp既能与药物结合，又能与ATP结合，ATP供能使细胞内药物泵出细胞外，降低了细胞内药物浓度使细胞产生耐药性。根据P-gp的作用机制，有研究发现通过抑制骨肉瘤耐药株中P-gp的表达，提高细胞内阿霉素的浓度可有效地逆转肿瘤细胞的耐药性。Baldini等［8］对92例高级别骨肉瘤的研究表明，28例骨肉瘤P-gp高表达患者的总生存率与64例P-gp低表达患者相比，总生存率明显降低。而P-gp表达与性别、年龄、坏死程度、组织学分型无关。除P-gp之外，其他的耐药相关蛋白及乳腺癌耐药相关蛋白也相继被发现［9］，所有的这些耐药相关蛋白都属于ATP结合的运输蛋白，这些蛋白能与药物结合，改变蛋白构象，将细胞内肿瘤药物排出以减少细胞内药物的蓄积。如多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP），位于外侧基底细胞膜上则会促进药物的吸收分解［10-11］。在跨膜蛋白中，MRP蛋白能促进细胞内药物排出，从而减少细胞内药物蓄积［12-14］。其中MRP1专门定位于小肠及脉络膜的基底部，MRP2被发现存在于肠肝肾的顶端细胞膜上［15-16］，通过与谷胱甘肽结合，转运非阴离子化合物如长春新碱和阿霉素，将药物泵出细胞外，从而降低细胞内药物蓄积。在此基础上，Gomes等［17］发现骨肉瘤化疗的敏感性与MDR1表达水平相关，MDR1表达水平越高，则细胞对化疗药物敏感性越低，肿瘤细胞越耐药。Alopecurone B（ALOB）是中药苦参的一种黄酮类提取物，研究显示，ALOB通过NF-κB信号通路抑制P-gp的作用，增加细胞内药物蓄积，调节阿霉素对MG-63阿霉素耐药细胞株的耐药作用，同时也能增强MG-63阿霉素耐药细胞株对其他传统化疗药物的敏感性［18］。此外，Trps1转录因子也与肿瘤细胞耐药有一定相关性，Trps1在恶性肿瘤细胞中被发现，编码包括9个锌指结构的转录区域的转录因子，并且作为乳腺癌和前列腺癌中潜在的细胞肿瘤标志物［19-20］。研究表明Trps1与MDR1/P-gp有直接相关作用，同时Trps1在骨肉瘤细胞系中能够促进MDR1/P-gp基因的表达。所以Trps1可能会作为一个有前途的分子靶点，在逆转骨肉瘤化疗耐药性机制中发挥重要作用［21］。

2　细胞内解毒系统

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是细胞内解毒系统的关键组成部分。谷胱甘肽在谷胱甘肽s转移酶（GST-π）的催化下与某些抗肿瘤药物形成复合物，成为多药耐药相关蛋白MRP1的底物，并与MRP1相结合被转运出细胞外，从而使细胞内药物浓度降低，减弱药物杀伤细胞的作用。人谷胱甘肽s转移酶P1（GSTP1）是细胞质的谷胱甘肽s转移酶细胞解毒酶家族的一部分，其作用是阻止各种各样的外源性物质进入细胞，包括突变剂、抗癌药物以及药物的代谢产物［22］。可以明确的是GSTP1的过表达与许多肿瘤的化疗耐药密切相关［23］。有研究发现在阿霉素和顺铂处理过的骨肉瘤耐药细胞株中GSTP1表达上调，表明当GSTP1在骨肉瘤SaoS2细胞中发生过表达时，细胞会产生对阿霉素和顺铂药物的耐药。相反，当HOS细胞受到阿霉素和顺铂药物处理后，敲除GSTP1基因，使其在HOS骨肉瘤细胞中表达受到抑制，结果是骨肉瘤细胞受到阿霉素和顺铂药物作用后出现凋亡以及细胞内大量的DNA损伤［24］。实验表明GSTP1通过参与MAPK信号通路，抑制JNK磷酸化作用或者促进ERK1/2和p38 MAPK磷酸化作用，避免细胞发生死亡或凋亡［25-27］。这是因为阿霉素或者顺铂等药物造成的细胞DNA损伤可介导ERK、JNK、p38 MAPK信号通路的磷酸化，而GSTP1可以调节这些信号通路在受阿霉素和顺铂影响的骨肉瘤细胞中的活性，从而影响细胞对化疗的耐药性。

3　信号转导通路的干扰

耐药机制往往是通过分子信号通路的激活介导，这些通路的激活会抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，这是为了弥补化疗和靶向药物对细胞抑制的影响。如m TOR信号通路。

m TOR属于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）蛋白激酶类家族成员，能控制细胞内mRNA的翻译及蛋白转运再调节蛋白翻译，在细胞生长和细胞代谢中起到重要作用。m TOR信号通路的改变在很多肿瘤中普遍存在，包括骨肉瘤。在人类骨肉瘤细胞系中，西罗莫司（雷帕霉素，抗真菌抗生素）能下调HOS细胞和KHOS/NP细胞中m TOR信号通路活性，延缓细胞周期G1期到S期的过渡并抑制骨肉瘤细胞生长［28］。

一项关于m TOR/p70S6K转导通路和骨肉瘤患者预后之间的相关性的临床研究结果表明，若患者m TOR/p70S6K转导通路存在高表达时，患者总生存期均较短，提示mTOR/p70S6K信号转导通路对骨肉瘤患者的预后和生存期有重要意义［29］，这更能证明m TOR通路为骨肉瘤临床治疗的一个潜在靶点。雷帕霉素作为阻断m TOR通路的免疫抑制剂，在Ⅰ期雷帕霉素临床药物试验中（PPTP）被证明起到广泛的抗肿瘤作用，包括骨肉瘤［30］。这些研究提示了雷帕霉素联合化疗药物治疗可能是骨肉瘤治疗的未来方向。

野生型p53基因定位于17号染色体短臂，研究表明p53作为抑癌基因在一个合适的时间间隔和足够的表达量时能抑制骨肉瘤细胞增殖。p53通过对TORC2靶点的作用比雷帕霉素更有效地起到抗骨肉瘤细胞增殖的作用，结论就是p53通过阻断PI3K/AKT/m TOR信号通路来抑制骨肉瘤转移、血管生成以及细胞增殖［31］。此外，将野生型p53转染进入多药耐药骨肉瘤细胞系后，通过抑制IGF-1r以及前凋亡蛋白p21和Bax在MDR骨肉瘤细胞系中的表达，可以提高化疗药物对多药耐药细胞系的敏感性［32］。

4　MicroRNA调节异常

M icroRNA（m iRNA）是一类非编码小RNA分子，参与广泛的生物学过程［33-35］。m iRNA突变、异常表达或异常加工均会影响m iRNA正常功能，从而导致靶蛋白表达异常。随着对m iRNA与肿瘤发生发展相关性研究的深入，越来越多的研究证明m iRNA异常表达与各种癌症有关［36-37］，且与临床化疗药物敏感性有一定相关性。如当miR-34a高度表达时，可提高骨肉瘤细胞对阿霉素、长春新碱的敏感性［38］，使化疗药物能更有效地抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。

改变特定的m iRNA表达，调节细胞进程会导致不同癌症的耐药性。如在骨肉瘤细胞系中，m iR-221和m iR-101通过PTEN/Akt通路介导，发生表达上调，从而产生骨肉瘤细胞对顺铂化疗药物的耐药［33-34］。

与成人正常的成骨细胞相比，m iR-202在骨肉瘤组织中的表达量增高，研究表明m iR-202通过TGF-β1介导表达，将m iR-202转染进入骨肉瘤细胞系，与PDCD4靶点结合后会出现骨肉瘤细胞对化疗药物的抵抗。相反，将m iR-202抑制剂转染进入骨肉瘤细胞系中，能够增强化疗药物敏感性以及促进肿瘤细胞凋亡［39］。

此外，研究表明在大部分肿瘤中，m iR-301a是一种具有上调功能的肿瘤致癌基因。在骨肉瘤中，阿霉素能够介导m iR-301a在骨肉瘤细胞中的表达。AMPKα1作为m iR-301a的直接靶点基因，通过m iR-301a过表达来调节阿霉素对骨肉瘤细胞的作用，促进HMGCR的表达以及抑制AMPKα1的表达。值得注意的是，m iR-301a能够减少阿霉素介导的细胞凋亡而抗m iR-301a靶点能够加强骨肉瘤细胞的凋亡，表明上调m iR-301a可增强骨肉瘤细胞对化疗药物的抵抗而出现耐药性。研究资料表明对化疗药物抵抗的这些骨肉瘤患者中m iR-301a和HMGCR都处于上调状态。这更加证明了miR-301a可能是一个潜在的骨肉瘤化疗耐药的标志物［40］。

此外，m iR-17-92在肿瘤中是专门研究多顺反子的集群，包含15个m iRNA形成4个“种子”家庭，分别是miR-17、m iR-18、m iR-19、m iR-92。在很多癌症中，如弥漫大B淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及骨肉瘤中都有以上这些m iRNA集群的扩增［41-43］。miR-17-92的直接目标基因包括E2F1、PTEN和p21［42］。m iR-17-92中两个成员m iR-17-5p和miR-18a属于5个高度致癌的m iRNA，在一些骨肉瘤细胞系中表达，提示疾病的预后不良［43］。由此可以看出，进一步探究骨肉瘤中m iR-17-92的作用是必要的。

m iRNA-155与细胞自噬相关，并能介导化疗药物在骨肉瘤细胞中的反应。miRNA-155能够在化疗药物介导的细胞自噬中高度表达，上调m iRNA-155表达水平可以提高化疗药物对细胞自噬的作用，证明miRNA-155通过细胞自噬作用来调节骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性［44］。此外，提高m iR-217的表达水平可增强对顺铂药物的敏感性［45］。骨肉瘤细胞对于阿霉素的化疗抵抗是与m iR-143的下调，ALDH1+CD133+的激活，自噬的激活以及相关的细胞死亡相关联的。miR-143可能在骨肉瘤化疗耐药性中起到一个至关重要的作用［46］。

5　自噬相关耐药

HMGB1是一种核内DNA结合蛋白，在许多细胞内都有表达，作为DNA的结合蛋白，HMGB1参与了DNA的复制、重组和转录，其分泌形式又可发挥细胞因子样作用。在骨肉瘤耐药形成过程中，HMGB1以分泌形式发挥免疫调节作用。HMGB1在骨肉瘤中促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，抑制骨肉瘤细胞凋亡［47］。值得注意的是，研究表明HMGB1可以通过介导自噬来增强药物抵抗，抑制HMGB1表达可以明显增强骨肉瘤细胞的药物敏感性。因此HMGB1可以作为骨肉瘤治疗的靶点基因干扰骨肉瘤耐药进程。

巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，M IF）是炎症相关的细胞因子，研究发现M IF影响乳腺癌对化疗药物的耐药性，同时一种新颖的雄烯二酮衍生物通过抑制M IF因子介导ROS调节的细胞自噬以及降低骨肉瘤细胞对化疗药物的耐药性［48］。自噬启动会介导细胞凋亡，但是自噬能够使肿瘤细胞免受化疗药物的影响，从而抑制肿瘤细胞凋亡［49］。P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PI3K信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K/Akt信号通路异常激活会促进细胞程序性死亡，抑制肿瘤的生长。在肿瘤治疗研究中，靶向药物阻断PI3K/Akt通路的作用越来越重要。P13K能介导对受到顺铂作用的MG63细胞系的细胞自噬，一定程度上提高细胞的自噬能力会降低MG63细胞对顺铂化疗药物的敏感性［50］。

6　肿瘤干细胞和相关药物耐药

肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是近年来研究的一个热点，它具有干细胞的特点，即自我更新、无限增殖及分化潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用［51］。1959年，MAKING［52］提出CSC假说，认为肿瘤中存在一种自我更新和无限增殖的亚群细胞，在肿瘤的发生发展以及耐药方面起到重要作用。CSC具有增强DNA修复能力，上调ABC转运蛋白的表达等作用，在骨肉瘤化疗治疗过程中能逃避化疗药物的毒性作用，一旦化疗药物作用消失，该类细胞可以通过自我更新、无限增殖使肿瘤出现复发转移［53］。因此，常规的化疗药物只能缩小肿瘤瘤体体积，而CSC未被化疗药物杀死，仍具有自我更新能力，导致肿瘤的复发和转移。在信号通路方面，有研究分析骨肉瘤干细胞具有持续激活Wnt/β-catenin信号和增强致瘤的潜力。因此，CSC成为肿瘤耐药的一个重要原因。

7　未来和展望

多药耐药是耐药的重要形式，也是导致骨肉瘤化疗失败的主要原因。骨肉瘤对化疗药物的耐药是一个多基因多方面作用的结果。本综述主要介绍了骨肉瘤抑制化疗药物的6种分子机制，但目前对于骨肉瘤化疗耐药的分子水平研究尚处于初期阶段，此外还存在其他机制能引起骨肉瘤细胞的耐药性，如APE1或ERCC增强DNA修复，干扰mTOR或IGF-IR信号转导通路，细胞凋亡和细胞自噬相关的抗化疗机制等。深入研究骨肉瘤耐药的分子机制对于研发新的化疗药物以及改善骨肉瘤化疗的效果具有重要意义。此外，骨肉瘤耐药分子标志物的寻找仍需进一步研究，这对于骨肉瘤化疗的治疗和骨肉瘤预后以及提高患者的生存期都有着重要的意义。

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A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.06

2015-11-30）

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