循环肿瘤细胞及游离DNA甲基化与前列腺癌的研究进展△

赵静　李小丽　索振河

郑州大学第一附属医院肿瘤科，郑州　450052

循环肿瘤细胞及游离DNA甲基化与前列腺癌的研究进展△

赵静李小丽索振河#

郑州大学第一附属医院肿瘤科，郑州450052

近年来，我国人口老龄化问题日益凸显，前列腺癌的发病率及病死率逐年升高，已成为男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。如何对前列腺癌患者进行尽早诊断及疗效评价是目前的研究热点。近十年来，血液循环肿瘤细胞（CTC）和循环游离肿瘤DNA（ctDNA）因其无创伤、实时采样和优先于影像学检查等特点，引起了肿瘤学研究领域的极大兴趣，被称为“液体活检”。CTC和ctDNA甲基化在肿瘤诊断、疗效评价和预后评估方面的价值，国内外已有大量文献报道。本综述主要介绍及分析CTC和ctDNA甲基化在前列腺癌研究及临床应用中的前景。

循环肿瘤细胞；循环游离DNA；前列腺癌；甲基化；生物标志物

我国人口老龄化形势日益严峻，男性前列腺癌发病例数逐年递增［1］。有统计数据表明，局限性前列腺癌患者五年生存率近100%，而伴有远处转移的肿瘤患者生存率仅为33.5%［2］。过去的10年中，前列腺癌的检测手段和治疗方法虽然有所进步，但患者确诊晚，转移及复发率高，是当前临床亟待解决的问题。研究证实循环肿瘤细胞（circulating tumour cell，CTC）及循环游离肿瘤DNA（cell free circulating tumor DNA，ctDNA）形成于肿瘤早期［3］，这为前列腺癌的早期诊断、疗效评价及预后分析等领域的研究提供了新的契机。

1　循环肿瘤细胞与血液游离DNA

CTC是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。有关CTC的报道，最早可以追溯到1869年。Ashworth［4］在1例肿瘤转移患者的循环血中检测到和原发癌灶生物学特征极其相似的细胞，而Engell［5］在1955年首次描述血液中的转移癌细胞的存在。这种由原发癌灶脱落并能转移至远距组织或器官的CTC是转移性肿瘤形成的主要来源［6］。由于微环境的改变，脱离癌灶的肿瘤细胞在外周血中生存期较短，存留在循环血中的肿瘤细胞具有生存力强、侵袭力高的特点［7］。CTC能够逐步集聚成癌栓，乃至进一步发展成为转移性肿瘤病灶。因此，通过对CTC的检测，能够进一步了解原发肿瘤发生转移的情况。CTC检测技术已在乳腺癌［8］、肺癌［9］和结直肠癌［10］等多种肿瘤的临床诊断和疗效评估中广泛应用，为动态监测患者病情进展和进行预后评估等提供了更有利的技术支持。

游离DNA主要由单链或双链DNA或二者的混合物组成，主要存在形式是一种无细胞状态的胞外DNA［11］。由于CTC、转移灶中的肿瘤细胞及一些非肿瘤细胞在坏死和凋亡时均会向外周血释放DNA，所以肿瘤患者中循环肿瘤细胞DNA只是循环游离DNA的一部分［12］。研究证实相较于健康个体，肿瘤患者的循环游离DNA水平更高，并且游离DNA与肿瘤组织表现出相同的生物学特性，这进一步告诉我们肿瘤患者的循环游离DNA主要来自循环肿瘤细胞DNA。大量文献研究表明，在消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、头颈部肿瘤、妇科肿瘤和皮肤肿瘤等多种肿瘤的早期诊断和预后评估方面，循环肿瘤游离DNA检测成为有效手段。

2　CTC检测与前列腺癌

目前，CTC的检测包含细胞富集和细胞分析两个步骤。外周血中CTC数量稀少，平均每105～107个单核细胞中存在1个CTC［13］，为提高检测的效率，需应用免疫磁性细胞分选法将CTC进行分离富集，主要依据肿瘤细胞的形态学特征及某些特异性标志物，利用CellSearch系统来检测CTC的存在［14-15］。CellSearch系统也是目前唯一通过美国FDA批准用于转移性前列腺癌患者临床CTC检测、预后评估和疗效判定的技术。de Bono等［16］在2008年应用CellSearch系统对231例去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者进行临床研究，发现CTC计数与CRPC患者的药物敏感性和生存期存在较大相关性。Goodman等［17］研究了33例抗雄激素治疗的前列腺癌患者，对CTC、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、血清睾酮和前列腺特异性抗原（PSA）与疗效的相关性进行了评估，结果表明CTC是评估激素敏感性前列腺癌患者预后的有效依据。Schwarzenbach等［18］对81例前列腺癌患者外周血CTC进行检测，发现外周血CTC与前列腺癌的分期、Gleason评分存在密切关系，CTC计数可以用来评估患者的病情进展。在实际临床应用中，动态观察CTC的变化方便实时评价药物疗效及患者预后，但CTC计数最佳临界值的设定仍是争议的焦点。

在过去大量的CTC计数相关研究基础上，发现CTC能够反映肿瘤的分子特征［19］，CTC的分子改变也逐步成为近年来的研究新热点。Darshan等［20］研究证实CRPC患者外周血CTC中AR的亚细胞水平定位与患者对多西他赛化疗的反应密切相关。Antonarakis等［21］研究发现在AR-雄激素受体剪接变异体7（V7）阳性的CRPC患者中，紫杉烷的疗效优于阿比特龙，而AR-V7阴性的患者中两种药物的疗效相当，推测AR-V7可用于指导CRPC患者化疗药物的选择。Sun等［22］研究发现T-LAK细胞源蛋白激酶（TOPK）在肿瘤细胞中高表达，将TOPK敲除后CTC的迁移能力明显下降，TOPK可能作为CTC的一个潜在检测标志和前列腺癌治疗靶点。Chen等［23］研究发现上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关基因，如乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase1，ALDH1）、雌激素受体β（ESR2）等，在CRPC患者中的表达显著高于激素敏感型前列腺癌患者。CTC的分子和基因检测是目前研究肿瘤特征的较为可行的一种手段，有助于靶向治疗以及肿瘤耐药机制的研究，有助于推动精准医疗的进一步发展，根据患者肿瘤的分子特征制定个体化的治疗方案指日可待。

3　循环游离DNA甲基化与前列腺癌

DNA序列以外的改变即表观遗传学改变在肿瘤的发生发展中具有重要作用。当今研究主要集中在DNA甲基化修饰方面，大量文献表明基因启动子区域的高甲基化致使相关基因表达沉默，调控细胞周期异常，侵袭力改变，DNA异常修复等，极大程度上影响前列腺癌的病理进展及临床预后。癌甲基化蛋白1（hypermethylated in cancer 1，HIC1）基因具有抑制肿瘤细胞生长、迁移和侵袭的功能，当激活前列腺癌细胞荷瘤小鼠体内沉默的HIC1基因，可以观察到其明显的抑癌基因作用［24］。原钙黏附蛋白8（protocadherin 8，PCDH8）基因编码钙黏素相关蛋白受体，其高表达可以抑制肿瘤细胞的生长和浸润，其甲基化导致的基因功能失活参与肿瘤的形成和恶性行为进展［25］。属于原钙黏蛋白家族成员的PCDH10以及PCDH17也参与前列腺癌的发生、发展［26-27］。GADD45a基因为生长阻滞和DNA损伤基因（grow th arrest and DNA damage gene，GADD），是调控DNA损伤修复的重要基因，在细胞凋亡中发挥重要的作用［28］。通常在环境损伤因子作用后，随着DNA修复途径的启动而诱导产生。Reis等［29］通过检测34例前列腺癌患者和48例前列腺良性肿瘤患者的血清GADD45a基因甲基化水平，发现前列腺癌组织中的GADD45a甲基化的发生率明显高于前列腺良性肿瘤组织。miRNA是一类具有调节基因表达功能的19～25 bp的小分子RNA，能诱导特定的靶mRNA降解或阻抑其翻译。Lin等［30］研究发现前列腺癌中m iR-31基因启动子区域DNA高甲基化导致其表达沉默，AR表达升高，有利于前列腺癌的恶性行为发生。miR-124的高表达具有抑制细胞增殖、迁移的作用，在AR阴性的前列腺癌细胞中m iR-124高甲基化发生率明显增加［31］。大量研究证实m iR-143、miR-218、m iR-375、m iR-22、m iR-29a等高甲基化也参与前列腺癌形成［32-35］。此外，还有激素应答相关基因视黄酸受体β（RARB）［36］、信号转导基因配对样同源域转录因子2（PITX2）［37］、谷胱甘肽S-转移酶1（glutathione S-transferasepi 1，GSTP1）［38］等基因，其启动子区域的异常甲基化与前列腺癌的发生、发展及预后有着密切关系。游离DNA甲基化的存在是前列腺癌中普遍现象，因其发生于前列腺肿瘤形成前期，为临床早期筛查和检测提供了帮助。

4　结论

CTC检测被称为“液体活检”，安全无创，对疾病分子特征的检测具有实时、动态的优点。越来越多的研究表明，循环肿瘤细胞对于评价疗效、指导癌症治疗及评估患者预后均有一定临床价值。当患者采用化疗、靶向治疗或生物治疗后，原始肿瘤组织已不复存在，检测CTC就成为实时监测药效、观察病情进展不可或缺的工具。但是，应该明确肿瘤这一细胞群体具有高度异质性，目前对前列腺癌CTC的研究多围绕单个中心进行的小样本研究，其结果仅为我们评价CTC与肿瘤分期、分级及预后之间的关系提供了初步的临界值，要建立检测的金标准和设定精确的阈值，仍需进行大规模、多样本的深入研究。若能在患者接受治疗干预前检测CTC计数，建立基数水平，治疗的同时动态检测CTC数目变化，则可为患者的预后评估、疗效监测、个性化方案制定提供更加翔实准确的评价依据。前列腺癌DNA甲基化检测作为新的检测手段，其敏感性和特异性也是亟待解决的问题。希望通过CTC计数和循环前列腺癌细胞DNA及其甲基化的检测和分析，寻找并筛选出一些敏感性和特异性更高的分子指标，实现前列腺癌的早期诊断，为患者的个体化治疗提供良好的靶点，为肿瘤学的临床应用开辟一个新的领域。

［1］李鸣，张思维，马建辉，等.中国部分市县前列腺癌发病趋势比较研究［J］.中华泌尿外科杂志，2009，30（6）:368-370.

［2］那彦群，郭震华.实用泌尿外科学［M］.北京:人民卫生出版社，2011:357.

［3］Heitzer E，Auer M，Ulz P，et al.Circulating tumor cells and DNA as liquid biopsies［J］.Genome Med，2013，5（8）:73.

［4］Ashworth TR.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death［J］. Austr Med J，1869，14:146-147.

［5］Eengell HC.Cancer cells in the circulating blood；a clinical study on the occurrence of cancer cells in the peripheral blood and in venous blood draining the tumour area at operation［J］.Acta Chir Scand Suppl，1955，201:1-70.

［6］Maheswaran S，Haber DA.Circulating tumor cells:a w indow into cancer biology and metastasis［J］.Curr Opin Genet Dev，2010，20（1）:96-99.

［7］Zhe X，Cher ML，Bonfil RD.Circulating tumor cells:finding the needle in the haystack［J］.Am J Cancer Res，2011，1（6）:740-751.

［8］Cristofanilli M，Budd GT，Ellis MJ，et al.Circulating tumor cells，disease progression，and survival in metastatic breast cancer［J］.N Engl J Med，2004，351（8）:781-791.

［9］Punnoose EA，Atwal S，Liu W，et al.Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer:association w ith clinical endpoints in a phase II clinical trial of pertuzumab and erlotinib［J］.Clin Cancer Res，2012，18（8）:2391-2401.

［10］Cohen SJ，Punt CJ，Iannotti N，et al.Prognostic significance of circulating tumor cells in patients w ith metastatic colorectal cancer［J］.Ann Oncol，2009，20（7）:1223-1229.

［11］Tsujiura M，Ichikawa D，Konishi H，et al.Liquid biopsy of gastric cancer patients:circulating tumor cells and cellfree nucleic acids［J］.World J Gastroenterol，2014，20（12）: 3265-3286.

［12］A lix-Panabières C，Schwarzenbach H，Pantel K.Circulating tumor cells and circulating tumor DNA［J］.Annu Rev Med，2012，63:199-215.

［13］Sleijfer S，Gratama JW，Sieuwerts AM，et al.Circulating tumour cell detection on its way to routine diagnostic implementation［J］.Eur J Cancer，2007，43（18）:2645-2650.

［14］李帅，刘晓强.泌尿系统肿瘤循环肿瘤细胞的检测［J］.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2011，3（4）:237-239.

［15］Danila DC，Fleisher M，Scher HI.Circulating tumor cells as biomarkers in prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2011，17（12）:3903-3912.

［16］de Bono JS，Scher HI，Montgomery RB，et al.Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2008，14（19）:6302-6309.

［17］Goodman OB，Symanowski JT，Loudyi A，et al.Circulating tumor cells as a predictive biomarker in patients w ith hormone-sensitive prostate cancer［J］.Clin Genitourin Cancer，2011，9（1）:31-38.

［18］Schwarzenbach H，A lix-Panabières C，Müller I，et al.Cellfree tumor DNA in blood plasma as a marker for circulating tumor cells in prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15（3）:1032-1038.

［19］Holcomb IN，Grove DI，Kinnunen M，et al.Genom ic alterations indicate tumor origin and varied metastatic potential of dissem inated cells from prostate cancer patients［J］. Cancer Res，2008，68（14）:5599-5608.

［20］Darshan MS，Loftus MS，Thadani-Mulero M，et al.Taxane-induced blockade to nuclear accumulation of the androgen receptor predicts clinical responses in metastatic prostate cancer［J］.Cancer Res，2011，71（18）:6019-6029.

［21］Antonarakis ES，Lu C，Luber B，et al.Androgen Receptor Splice Variant 7 and Efficacy of Taxane Chemotherapy in Patients With Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer［J］.JAMAOncol，2015，1（5）:582-591.

［22］Sun H，Zhang L，Shi C，et al.TOPK is highly expressed in circulating tumor cells，enabling metastasis of prostate cancer［J］.Oncotarget，2015，6（14）:12392-12404.

［23］Chen CL，Mahalingam D，Osmulski P，et al.Single-cell analysis of circulating tumor cells identifies cumulative expression patterns of EMT-related genes in metastatic prostate cancer［J］.Prostate，2013，73（8）:813-826.

［24］Zheng J，Wang J，Sun X，et al.HIC1 modulates prostate cancer progression by epigenetic modification［J］.Clin Cancer Res，2013，19（6）:1400-1410.

［25］Niu WB，Gui SL，Lin YL，et al.Promoter methylation of protocadherin8 is an independent prognostic factor for biochemical recurrence of early-stage prostate cancer［J］.Med Sci Monit，2014，20:2584-2589.

［26］Wang L，Xie PG，Lin YL，et al.Aberrant methylation of PCDH10 predicts worse biochem ical recurrence-free survival in patients w ith prostate cancer after radical prostatectomy［J］.Med Sci Monit，2014，20:1363-1368.

［27］Lin YL，Xie PG，Wang L，et al.Aberrant methylation of protocadherin 17 and its clinical significance in patients w ith prostate cancer after radical prostatectomy［J］.Med Sci Monit，2014，20:1376-1382.

［28］Hollander MC，Fornace AJ.Genom ic instability，centrosome amplification，cell cycle checkpoints and Gadd45a［J］.Oncogene，2002，21（40）:6228-6233.

［29］Reis IM，Ramachandran K，SpeerC，etal.Serum GADD45a methylation is a useful biomarker to distinguish benign vs malignant prostate disease［J］.Br J Cancer，2015，113（3）: 460-468.

［30］Lin PC，Chiu YL，Banerjee S，et al.Epigenetic repression of m iR-31 disrupts androgen receptor homeostasis and contributes to prostate cancer progression［J］.Cancer Res，2013，73（3）:1232-1244.

［31］Chu M，Chang Y，Guo Y，et al.Regulation and methylation of tumor suppressor m iR-124 by androgen receptor in prostate cancer cells［J］.PLoS One，2015，10（4）:e0116197.

［32］Chu H，Zhong D，Tang J，et al.A functional variant in miR-143 promoter contributes to prostate cancer risk［J］. Arch Toxicol，2016，90（2）:403-414.

［33］Han G，Fan M，Zhang X.m icroRNA-218 inhibits prostate cancer cell grow th and promotes apoptosis by repressing TPD52 expression［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，456（3）:804-809.

［34］Costa-Pinheiro P，Ramalho-Carvalho J，Vieira FQ，et al. M icroRNA-375 plays a dual role in prostate carcinogenesis［J］.Clin Epigenetics，2015，7（1）:42.

［35］Pasqualini L，Bu H，Puhr M，et al.miR-22 and miR-29a Are Members of the Androgen Receptor Cistrome Modulating LAMC1 and Mcl-1 in Prostate Cancer［J］.Mol Endocrinol，2015，29（7）:1037-1054.

［36］Moison C，Assemat F，Daunay A，et al.Synergistic chromatin repression of the tumor suppressor gene RARB in human prostate cancers［J］.Epigenetics，2014，9（4）:477-482.

［37］Vasiljević，Ahmad AS，Carter PD，et al.DNA methylation of PITX2 predicts poor survival in men w ith prostate cancer［J］.Biomark Med，2014，8（9）:1143-1150.

［38］Kanwal R，Pandey M，Bhaskaran N，et al.Protection against oxidative DNA damage and stress in human prostate by glutathione S-transferase P1［J］.Mol Carcinog，2014，53（1）:8-18.

R737.25

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.05

2015-12-01）

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