蔓荆子黄素抑制p53突变型人肺癌细胞生长及其机制研究

许　刚，张云锋，孟　磊，周章剑，张　昊，宋永春*(.西安交通大学第一附属医院肿瘤外科，西安 7006；. 西安交通大学第一附属医院胸外科，西安 7006)



蔓荆子黄素抑制p53突变型人肺癌细胞生长及其机制研究

许刚1，张云锋2，孟磊1，周章剑1，张昊1，宋永春1*(1.西安交通大学第一附属医院肿瘤外科，西安 710061；2. 西安交通大学第一附属医院胸外2科，西安 710061)

摘要：目的了解蔓荆子黄素对p53突变型人肺癌H322细胞增殖的影响，并对其机制进行初步研究。方法在不同时间点(24，48和72 h)采用MTT法检测不同浓度(0，0.1，0.2，0.5，1.0 μmol·L-1)蔓荆子黄素对细胞增殖的影响。在不同浓度蔓荆子黄素的作用下，采用Western blot法检测c-myc基因表达情况。 结果蔓荆子黄素能抑制H322细胞增殖，且呈剂量和时间依赖性，24，48和72 h的IC50分别为0.577，0.501和0.473 μmol·L-1。不同浓度的蔓荆子黄素在同一时间点、相同浓度的蔓荆子黄素在不同时间点对 H322细胞增殖的抑制作用均存在明显差异(P<0.05)。c-myc基因表达与蔓荆子黄素的浓度呈反比。 结论蔓荆子黄素能抑制人肺癌H322细胞的增殖，其机制可能是通过抑制c-myc的表达。

关键词：蔓荆子黄素；肺癌；增殖；c-myc蛋白

肺癌是全世界发病率和病死率都位居第1的恶性肿瘤，每年有近160万患者死于该病[1]。蔓荆子黄素是植物蔓荆子果实的有效成分，是众多具有抗肿瘤活性的中药成分之一[2-4]。多项研究显示， 蔓荆子黄素是一种可以抑制恶性细胞增殖和引起凋亡的多靶向分子[2,5-6]。既往的研究发现， 蔓荆子黄素对p53突变的乳腺癌Hs578T细胞增殖有抑制作用[7]。目前，蔓荆子黄素对p53突变的人肺癌细胞增殖的影响及其机制仍不清楚，而p53突变也是肺癌对很多化疗药物产生耐药的一个分子生物学基础[8-9]。所以研究蔓荆子黄素对p53突变肺癌细胞增殖的影响及其机制有着重要的意义。

1仪器与材料

1.1仪器细胞培养箱，净化工作台，倒置荧光显微镜，水浴锅，电转仪，流式细胞仪，LEICA-Q550CW图像采集与分析系统等。

1.2材料与试剂细胞株(人肺癌H322细胞)由西安交通大学医学部第一附属医院转化医学中心馈赠。蔓荆子黄素购自陕西盺泰生物科技有限公司(质量分数≥98%)。配制：溶解于二甲基亚砜(DMSO)。存储液的浓度为1 mmol·L-1(0.374 mg·mL-1)，4 ℃下储存备用。使用前用含0.1 mL·L-1胎牛血清的DMEM培养基制备成5种浓度(0，0.1，0.2，0.5和1.0 μmol·L-1)的工作液。噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。胎牛血清和DMEM培养基购自Gibco公司。BCA蛋白质试剂盒购自Pierce公司。一抗：c-myc鼠单抗以及β-actin鼠多抗；二抗：羊抗鼠HRP单抗， 均购自Abcam公司。

2方法

2.1细胞培养H322细胞常规培养于DMEM培养基中(含0.1 mL·L-1胎牛血清，100 u·mL-1青霉素，100 u·mL-1链霉素)，经2.5 mg·L-1胰蛋白酶溶液消化传代，细胞在37 ℃、饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培养。

2.2细胞增殖实验(MTT法) 将H322细胞以5×103个/孔接种于96孔培养板中，每组设置3个复孔。24 h后实验组更换含各种浓度的蔓荆子黄素(0.1，0.2，0.5和1.0 μmol·L-1)的培养基，阴性对照组更换不含蔓荆子黄素的培养基， 分别于24，48和72 h后更换为100 μL培养基和20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，继续培养4~6 h后，吸除MTT溶液，加入DMSO溶液150 μL/孔，置于摇床振荡10 min后用酶标仪在490 nm处测吸光度值(A值)。细胞生长率=[实验组A值/阴性对照A值]×100%。

2.3Western blot检测使用不同浓度蔓荆子黄素工作液处理细胞72 h后收集细胞，吸去培养基后，加入含蛋白酶抑制剂和去磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液使细胞充分裂解，离心后留取上清液，经BCA蛋白质试剂盒定量后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，上样量均为30 μg，再用PVDF膜进行转膜。PVDF膜经蛋白封闭后，4 ℃下一抗孵育过夜；然后加入二抗，常温下孵育3 h后用ECL化学发光法配置HRP底物，按照1∶1的比例充分混合1 min后，均匀滴加至膜上，反应1 min后将膜置于ChemiDocTMMP成像系统进行检测，记录曝光1~65 s的图像，选取对比度最明显的照片进行解读。

2.4统计学方法应用GraphPad Prism统计软件处理数据，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)及t检验分析各组间的差异是否具有统计学意义，显著性水平α=0.05。

3结果

3.1蔓荆子黄素对H322细胞增殖的抑制作用蔓荆子黄素对H322细胞增殖在24，48和72 h有抑制作用，蔓荆子黄素抑制人肺癌H322细胞增殖作用的IC50分别为0.577，0.501和0.473 μmol·L-1。不同浓度蔓荆子黄素在同一时间点对H322细胞增殖的抑制作用与对照组相比均存在明显差异，见表1。双因素方差分析(two-way ANOVA)显示，各组间生长率有显著性差异(P<0.000 1)。

表1不同浓度蔓荆子黄素对H322细胞增殖的影响

Tab.1 Effects of vitexicarpin on proliferation of H322 cell

±s)

注：*表示与对照组相比，差异具有统计学意义。3.2蔓荆子黄素对H322细胞增殖影响的比较不同浓度的蔓荆子黄素作用于H322细胞24，48和72 h，均表现出明显的抗增殖作用，且各组间有统计学差异。在不同浓度的蔓荆子黄素作用下，H322细胞生长均受到抑制，生长率逐渐下降，浓度越大，细胞存活率越低。相同浓度的蔓荆子黄素随着时间的推移，对细胞生长的抑制力增加，生长率逐渐下降。但其对照组生长率不受影响，见图1。所以，蔓荆子黄素对人肺癌H322细胞有明显抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。

图1不同浓度蔓荆子黄素对H322细胞增殖的影响

Fig.1 Effects of vitexicarpin on proliferation of H322 cell

3.3蔓荆子黄素对H322细胞c-myc蛋白表达的影响在蔓荆子黄素作用72 h后，采用Western blot检测H322细胞c-myc蛋白的表达，结果显示，随着蔓荆子黄素浓度的升高，细胞中c-myc蛋白表达量逐渐降低。 见图2。

图2　不同蔓荆子黄素处理H322细胞c-myc蛋白的表达情况

Fig.2 Expression of c-myc protein in H322 cell treated with vitexicarpin

4讨论

蔓荆子黄素又叫紫花牡荆素，是一种从中药蔓荆子中提取的具有广泛药理活性的多甲氧基黄酮类化合物，是蔓荆子抗肿瘤的主要活性成分。目前国内外对蔓荆子黄素抗肿瘤作用机制研究较少，有研究提示蔓荆子黄素可能通过影响肿瘤细胞有丝分裂的纺锤体形成而导致细胞周期停滞在G2/M期，并诱导凋亡[10-12]。同时它还能诱导p21蛋白表达，抑制 Cdk1活性，阻滞细胞G2/M期过渡[13]。

既往的研究发现，蔓荆子黄素能使p53突变的乳腺癌Hs578T细胞的增殖能力受到明显抑制，并抑制c-myc和Bcl-2的表达，促进p21的表达，而且Bcl-2和p21的改变可以被c-myc基因所阻断[7]。但是，在p53野生型的人乳腺癌MCF-7细胞中并无此现象[7]。这说明同一药物对不同分子分型的肿瘤细胞有着不同的作用机制，这也是对癌症进行基因分型研究的重要意义。p53基因突变也是肺癌常见的遗传改变[14-15]，至今尚未见蔓荆子黄素对p53突变型肺癌细胞的研究报道。在本研究中，我们发现蔓荆子黄素同样抑制了p53突变型人肺癌H322细胞的增殖，为了进一步研究其抑制增殖作用的机制，我们通过Western blot检测了不同浓度蔓荆子黄素处理H322细胞的c-myc蛋白表达情况。结果显示，随着蔓荆子黄素浓度的增加，c-myc蛋白的表达下降。c-myc是一种原癌基因，在各种肿瘤细胞中有高表达，并且在肿瘤的增殖、侵袭过程中起着重要作用[16-17]。同时，c-myc的异常表达造成其他癌基因的激活，促进肿瘤的发生和发展。我们推测蔓荆子黄素对H322细胞的增殖抑制作用是通过c-myc发挥作用的。c-myc是蔓荆子黄素抑制H322细胞增殖机制的重要环节，所以我们未来的研究将围绕蔓荆子黄素通过c-myc抑制肺癌细胞增殖的具体上下游机制来开展，进一步阐明蔓荆子黄素抗肿瘤作用的具体机制，也为p53突变型肺癌的治疗提供新的靶点。

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Inhibitory effects of vitexicarpin on mutated p53 lung cancer cell and its mechanism

XU Gang1，ZHANG Yunfeng2，MENG Lei1，ZHOU ZhangJian1， ZHANG Hao1，SONG Yongchun1*(1. Department of Surgical Oncology，the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061，China；2. The 2nd Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect and mechanism of vitexicarpin in H322 cell line，of which p53 gene was mutanted natively. Methods Cells were treated with various concentrations of vitexicarpin(0，0.1，0.2，0.5 and 1.0 μmol·L-1). MTT assays were used to detect cell proliferation, and Western blot assays were used to detect c-myc protein expression at different time points(24，48 and 72 h) with different doses of vitexicarpin. Results Proliferation of H322 cell was inhibited markedly by vitexicarpin，with IC50s was 0.577，0.501 and 0.473 μmol·L-1in different time points(24，48 and 72 h). Cells pretreated with higher concentrations of vitexicarpin expressed less c-myc. Conclusion The suppress mechanism of vitexicarpin for malignant tumour maybe through c-myc in p53 mutated H322 cell.

Key words:vitexicarpin； lung cancer； proliferation； c-myc protein

(收稿日期：2015-10-10)

*通信作者：宋永春，男，博士，主治医师

作者简介：许刚，男，在读博士研究生，助理研究员

基金项目：陕西省社会发展科技攻关项目(编号：2014k11-01-01-22)

中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0161-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.015